陳新峰，張治國(guó)，王君虹，周利亙

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021)

膠原蛋白是人體內(nèi)含量最多、分布最廣泛的蛋白質(zhì)，是一種與組織和器官功能密切相關(guān)的功能性蛋白。膠原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性［1-3］和生物活性等特性，被愈來(lái)愈多的消費(fèi)者所認(rèn)識(shí)。膠原蛋白制品已被廣泛應(yīng)用于食品、保健食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，市場(chǎng)需求急劇增加［4］。天然膠原蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血壓、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、抗疲勞等生理調(diào)節(jié)功能的小肽，是極具發(fā)展前景的功能因子，也是當(dāng)前醫(yī)藥、食品界最熱門的研究課題之一［5-6］。試驗(yàn)研究以畜產(chǎn)加工下腳料皮、骨等為原料，應(yīng)用風(fēng)味蛋白酶水解技術(shù)提取畜產(chǎn)膠原蛋白，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝參數(shù)?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和儀器

畜產(chǎn)膠原蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制;95萬(wàn)U·g-1風(fēng)味蛋白酶，上海海洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;21萬(wàn)U·g-1堿性蛋白酶、120萬(wàn)U·g-1木瓜蛋白酶、3.7萬(wàn)U·g-1菠蘿蛋白酶、247萬(wàn)U·g-1中性蛋白酶、脂肪酶，南寧龐博生物工程有限公司產(chǎn)品;甲醛、氫氧化鈉、濃硫酸，均為分析純。

儀器設(shè)備有ALB-224電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;DK-8 D恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;PB-10型p H計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 制備和檢測(cè)

1.2.1 畜產(chǎn)膠原蛋白溶液的制備

取畜產(chǎn)加工下腳料豬皮除去表面脂肪，破碎后加1倍水，攪拌均勻，30℃恒溫水浴，加入NaOH調(diào)節(jié)pH值為9.0，加入0.1%的脂肪酶酶解30 min，85℃滅酶5 min，冷卻后漂洗，然后進(jìn)行組織搗碎，配成50%的畜產(chǎn)膠原蛋白液，待用。

1.2.2 畜產(chǎn)膠原蛋白的酶水解

將預(yù)處理的畜產(chǎn)膠原蛋白，配成蛋白含量為4%的溶液，升溫至90℃，保持15 min預(yù)處理，調(diào)節(jié)到一定溫度，并調(diào)節(jié)pH值，添加蛋白酶，恒溫酶解，酶解過(guò)程中維持pH值穩(wěn)定。酶解完畢后，100℃滅酶10 min，過(guò)濾，取上清液。

1.2.3 檢測(cè)方法

所有樣品均取樣測(cè)定3次，取平均值?？偟堪碐B 5511—1985的方法測(cè)定，水解度采用游離氨基酸態(tài)氮甲醛快速滴定法［7］測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶作供選酶，按照蛋白酶各自的適宜溫度和p H值條件，酶解畜產(chǎn)膠原蛋白，測(cè)定不同蛋白酶酶解畜產(chǎn)膠原蛋白的水解度。通過(guò)比較各自的水解度，選擇合適的蛋白酶。

1.3.2 風(fēng)味蛋白酶單因素試驗(yàn)

［E/S］試驗(yàn)。在pH 7.0、50℃下，選取不同［E/S］條件，酶解5.0 h、分別測(cè)定水解度。

p H試驗(yàn)。在 ［E/S］1/10、溫度 50℃條件下，選取不同的p H條件，酶解5.0 h，測(cè)定各自的水解度。

酶解時(shí)間試驗(yàn)。在 ［E/S］1/10、pH值什7.0、溫度50℃條件下，選取不同的酶水解時(shí)間，測(cè)定各自的水解度。

酶解溫度試驗(yàn)。在 ［E/S］1/10、pH值7.0條件下、選取不同的酶解溫度，酶解5.0 h，測(cè)定各自的水解度。

1.3.3 風(fēng)味蛋白酶正交試驗(yàn)

進(jìn)行4因素正交試驗(yàn)，設(shè) A因素為 ［E/S］值，B因素為pH值，C因素為酶解時(shí)間和D因素為酶解溫度，采用L9(34)正交表進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶的效果

由圖1看出，不同蛋白酶對(duì)畜產(chǎn)膠原蛋白的酶解效果各不相同，其中風(fēng)味蛋白酶酶解水解度為14%，明顯優(yōu)于其它4種蛋白酶。因此，對(duì)風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶水解度比較

2.2 單因素的效果

2.2.1 ［E/S］值

由圖2看出，風(fēng)味蛋白酶水解度隨著 ［E/S］的升高而增大，當(dāng) ［E/S］值上升到1/10后，達(dá)到最高點(diǎn)，超過(guò)1/10后，水解度增加甚微，因此，選用 ［E/S］為1/10較為適宜。

圖2 酶比底物 ［E/S］對(duì)水解度的影響

2.2.2 pH值

由圖3看出，風(fēng)味蛋白酶酶解畜產(chǎn)膠原蛋白的水解度從pH值為5時(shí)開(kāi)始，隨著pH值的上升而相應(yīng)提高，當(dāng)pH值為 7.0時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，pH值超過(guò)7.0后開(kāi)始下降，表明中性條件對(duì)風(fēng)味蛋白酶的酶解效果優(yōu)于酸性和堿性條件，選用pH值 7.0較為適宜。

圖3 pH對(duì)水解度的影響

2.2.3 時(shí)間

由圖4看出，風(fēng)味蛋白酶水解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而相應(yīng)增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到5.0 h時(shí)，水解度達(dá)到最高，超過(guò)5.0 h后幾乎保持不變，因此，酶解時(shí)間選用5.0 h較為適宜。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

2.2.4 溫度

由圖5看出，風(fēng)味蛋白酶酶解畜產(chǎn)膠原蛋白的水解度隨著溫度的上升而相應(yīng)提高，50℃達(dá)最高點(diǎn)，超過(guò)50℃開(kāi)始下降，酶解溫度50℃較為適宜。

圖5 酶解溫度對(duì)水解度的影響

2.3 優(yōu)化因素的效果

由表1看出，各試驗(yàn)因素對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解效果的影響［E/S］ ＞pH＞酶解溫度＞酶解時(shí)間，其優(yōu)化工藝參數(shù)為A3B2C2D2，即 ［E/S］3/25，酶解溫度50℃，pH值 7.0，酶解時(shí)間5.0 h。將優(yōu)化組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其水解效果優(yōu)于正交試驗(yàn)表中任1組合，水解度達(dá)到19.53%。

表1 風(fēng)味蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果

3 小結(jié)

采用風(fēng)味蛋白酶水解畜產(chǎn)膠原蛋白，其水解度明顯優(yōu)于其它4種試驗(yàn)用蛋白酶，且酶解液苦澀味低于其他4種蛋白酶水解液。試驗(yàn)研究表明，風(fēng)味蛋白酶酶解畜產(chǎn)膠原蛋白的優(yōu)化工藝參數(shù)為:［E/S］值3/25，酶解溫度50℃，pH值7.0，酶解時(shí)間5.0 h;水解度可達(dá)到19.53%。

［1］ 石崗.生物活性肽進(jìn)展 ［J］.北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002(3):9-13.

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