范德生 李澤民 孫寧

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院病理科，上海 200021；2.廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 東莞 523808

姜黃素對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的體外實(shí)驗(yàn)研究

范德生1李澤民1孫寧2

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院病理科，上海 200021；2.廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 東莞 523808

背景與目的：鼻咽癌放射治療后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因之一。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa)根莖中提取的一種酚性色素，具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化作用。本研究旨在探討姜黃素對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法：以10、20、40和80 μmol/L姜黃素分別處理CNE-2Z細(xì)胞24、48 h后，MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。應(yīng)用Transwell小室進(jìn)行人工重組基底膜(matrigel)侵襲和運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，觀察姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)不同濃度姜黃素作用后細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達(dá)水平的變化。結(jié)果：應(yīng)用姜黃素處理后，人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，且作用呈時(shí)效-量效依賴關(guān)系；同時(shí)細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯降低；EGFR基因和蛋白表達(dá)亦明顯減弱。結(jié)論：姜黃素能夠減弱人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的體外侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與降低EGFR的表達(dá)有關(guān)。

鼻咽癌； 姜黃素； 侵襲； 轉(zhuǎn)移

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)多發(fā)于廣東珠江三角洲地區(qū)及兩廣西江流域，俗稱“廣東瘤”。鼻咽癌生長(zhǎng)位置深并有重要神經(jīng)血管相鄰，不易發(fā)現(xiàn)且不易手術(shù)切除。90%左右的鼻咽癌為未分化型非角化性癌，對(duì)放射線殺傷較敏感，因而放射治療是鼻咽癌首選治療手段，但仍有40%～60%鼻咽癌患者死于鼻咽或頸部復(fù)發(fā)和(或)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa)根莖中提取的一種酚性色素，具有抗腫瘤［1］、抗氧化［2］、抗炎［3］、抑制血管生成［4］及調(diào)節(jié)多藥耐藥基因［5］的作用。近年來(lái)，有研究證實(shí)姜黃素能夠減少腫瘤細(xì)胞體內(nèi)及體外的侵襲和轉(zhuǎn)移［6-7］。本研究觀察了姜黃素對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并通過(guò)檢測(cè)與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達(dá)的變化，探討姜黃素影響鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2Z細(xì)胞由廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室分離并保存。其他藥品和試劑包括：姜黃素(綠天公司，杭州)，RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))，新生小牛血清(四季青生物材料工程公司，杭州)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) (Sigma，美國(guó))，細(xì)胞總RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒(Tiangen公司，北京)，鼠抗人EGFR單克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó))，兔抗人β-actin多克隆抗體，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG (H+L)(中杉生物技術(shù)有限公司，北京)，人工重組基底膜Matrigel膠(Sigma，美國(guó))，Tanswell Chamber (8 μm孔徑，Costar，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CNE-2Z細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%新生小牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，0.056% NaHCO3，調(diào)節(jié)pH值至7.4)，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整到所需細(xì)胞濃度，接種于96孔培養(yǎng)板(每孔150 μL)，按不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將培養(yǎng)液換成空白對(duì)照液和不同濃度的姜黃素溶液(10、20、40及80 μmol/L)，分別培養(yǎng)24 h或48 h。

每孔加入MTT 50 μL (濃度為5 mg/mL)，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4 h后終止。吸棄各培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩搖勻后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)490 nm處測(cè)各孔吸光度(D)值，不同濃度的姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的毒性以抑制率，計(jì)算公式為：細(xì)胞抑制率(%)=(D對(duì)照組-D實(shí)驗(yàn)組)/D對(duì)照組×100%。

1.2.3 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

取指數(shù)生長(zhǎng)期的各組不同濃度姜黃素處理的細(xì)胞，Trypsin-EDTA消化制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色做活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI-1640(含1%小牛血清)洗滌1次，然后用RPMI-1640 (含1%小牛血清)稀釋制備5.0×105mL-1的細(xì)胞懸液。Matrigel?置于冰上放置8 h，用預(yù)冷至0 ℃的無(wú)菌三蒸水稀釋Matrigel?至200 μg/mL。稀釋后的Matrigel?每孔按50 μL鋪入Transwell?上室，置于超凈工作臺(tái)過(guò)夜風(fēng)干。臨用前在Transwell?上室中加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液每孔100 μL，預(yù)溫至37 ℃，室溫100 r/min振搖90 min后，吸去液體以去除未結(jié)合的Matrigel?。細(xì)胞懸液按每孔100 μL加入Transwell?，每組2孔；Transwell?下室加入RPMI-1640 (含10 μg/mL Fibronectin、10%小牛血清)600 μL。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入甲醇和丙酮(1∶1)固定10 min。以PBS浸濕的棉簽拭去聚碳酸酯濾膜正面(靠近上室面)的細(xì)胞。蘇木精染色3 min，水洗，伊紅染色10 s，水洗，中性樹(shù)膠封片。于200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)PVPF濾膜的細(xì)胞數(shù)。每膜計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)隨機(jī)不同視野，以每視野細(xì)胞平均數(shù)代表侵襲能力，每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。

1.2.4 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中Transwell?上室的聚碳酸酯濾膜不鋪設(shè)Matrigel?，其余步驟與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)相同，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)

收集不同濃度姜黃素(0、10、20和40 μmol/L)作用細(xì)胞24 h，使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，采用一步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參照。參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Oligo計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物技術(shù)公司合成。E G F R上游引物：5’-GTGGCTGGTTATGTCCTCA-3’， 下游引物：5’-CAGTTTCTGGCAGTTCTCCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物3 7 7 b p；G A P D H上游引物：5’-GCATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物：5’-TGGGTGAGGAGGTGGAAA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物858 bp；反應(yīng)條件：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃逆轉(zhuǎn)錄失活5 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL的6×Loading Buffer，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/mL的EB)，電泳緩沖液為1×TAE，在50 V電壓下電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果。凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析，以EGFR與GAPDH擴(kuò)增條帶的峰面積比值進(jìn)行mRNA水平的相對(duì)定量。

1.2.6 Western blot 分析

用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，然后加細(xì)胞裂解液冰上放置20 min，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液定量分析。取已定量的總蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入1∶500稀釋的鼠抗人EGFR單克隆抗體，室溫溫育3 h，TBS洗滌后加入稀釋度1∶4 000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)，室溫溫育90 min；TBS洗滌后經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑溫育，暗室X片曝光顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用單因素方差分析，數(shù)據(jù)資料采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 12.0處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響

不同濃度姜黃素可以不同程度地抑制細(xì)胞增殖，同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且抑制率與姜黃素濃度呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1)。同時(shí)在40、80 μmo/L姜黃素作用細(xì)胞24 h后，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞質(zhì)空泡和顆粒增多，不規(guī)則細(xì)胞增多，并見(jiàn)大量細(xì)胞脫落，培養(yǎng)液中出現(xiàn)很多的懸浮細(xì)胞碎片，表明高濃度姜黃素不僅抑制細(xì)胞的增殖，還可能有細(xì)胞毒作用，可以直接殺傷CNE-2Z細(xì)胞。

2.2 姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞侵襲、運(yùn)動(dòng)能力的影響

Transwell體外侵襲和運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，以24 h穿過(guò)人工重組基底膜到達(dá)聚碳酸酯濾膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的大小。結(jié)果顯示姜黃素能抑制CNE-2Z細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)能力，與未加姜黃素的對(duì)照組細(xì)胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，表1)。

表 1 不同濃度姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的影響Tab. 1 Effect of different concentrations of curcumin on invasion and migration of CNE-2Z cells(n, ±s)

表 1 不同濃度姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的影響Tab. 1 Effect of different concentrations of curcumin on invasion and migration of CNE-2Z cells(n, ±s)

*: Compared with the control group, P＜0.001(P=0.000, respectively).

Curcumin concentration/μmol·L?1 Invasion Migration 0 (control) 67.67±7.234 95.67±2.309 10 54.33±4.041* 82.00±6.000*20 46.00±4.000* 65.69±5.686*40 34.67±3.786* 60.64±2.082*

2.3 姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞EGFR mRNA及蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均有EGFR mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增電泳帶約在377 bp處，對(duì)其進(jìn)行光密度掃描半定量分析結(jié)果顯示，CNE-2Z細(xì)胞在不同濃度姜黃素處理24 h后，EGFR mRNA的表達(dá)有不同程度的減少，隨姜黃素濃度的升高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，圖2)。Western blot結(jié)果顯示，不同濃度姜黃素處理細(xì)胞24 h后，EGFR蛋白的表達(dá)亦有不同程度的減少(圖3)。

3 討 論

近年來(lái)，植物來(lái)源的藥物越來(lái)越受到重視，從天然植物中尋找高效、低毒的抗腫瘤新藥，是腫瘤治療研究領(lǐng)域中的重要課題。Kuttan等［8］通過(guò)對(duì)姜黃提取物和姜黃素的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能明顯抑制CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有抗腫瘤特性。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，姜黃素具有確切的抗腫瘤活性［9-10］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在10～80 μmol/L濃度范圍內(nèi)，姜黃素在作用24 h和48 h后均可抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，且隨濃度的增加其抑制率呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本和最重要的生物學(xué)特性之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程， 從分子水平可將這個(gè)過(guò)程分為三步，即黏附、降解、運(yùn)動(dòng)。因此，具有抗黏附、抗運(yùn)動(dòng)或抗侵襲降解作用的化合物均可抑制惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為。1995年，Menon等［11］報(bào)道姜黃素可抑制高轉(zhuǎn)移鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 F10在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移，使肺臟腫瘤結(jié)節(jié)明顯減少，生存期延長(zhǎng)。2001年，沈曉鳴等［12］證實(shí)姜黃素對(duì)人肺癌細(xì)胞的體外侵襲、運(yùn)動(dòng)能力有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)以CNE-2Z細(xì)胞為觀察對(duì)象，獲得了姜黃素對(duì)CNE-2Z細(xì)胞株侵襲、運(yùn)動(dòng)影響的較為直接的證據(jù)。

表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)是一種小分子多肽，EGF作為一種配體與細(xì)胞膜上的EGFR結(jié)合，改變受體的三維構(gòu)象，使之二聚體化，進(jìn)而可激活眾多的下游信號(hào)路徑，包括PLCC、PI3K、小G蛋白、P21ras、rasGTP酶激活蛋白(GAP)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2 (grb2) 和src激酶家族等，其中研究較明確的主要有兩條途徑：一條是ras-raf-MEK-erk/MAPK途徑；另一條是PI3K-PKCIKK途徑，使IJBA磷酸化后導(dǎo)致NFJB移位至核內(nèi)，而將信息傳遞入核，該途徑與細(xì)胞移動(dòng)性的增強(qiáng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK途徑在癌細(xì)胞移動(dòng)過(guò)程早期起作用，PKC途徑在癌細(xì)胞移動(dòng)過(guò)程晚期起作用，EGFR的過(guò)表達(dá)能通過(guò)激活PKC途徑來(lái)補(bǔ)償MAPK途徑的損失，從而在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

EGFR是EGF的唯一受體，越來(lái)越多的研究證實(shí)EGFR的高表達(dá)與細(xì)胞惡變、腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成等相關(guān)。姚運(yùn)紅等［13］研究發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)移能力及途徑的腫瘤細(xì)胞的EGFR表達(dá)不一，但同一轉(zhuǎn)移能力和途徑的腫瘤細(xì)胞EGFR的表達(dá)存在一致性，說(shuō)明EGFR表達(dá)強(qiáng)弱能反映腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，并提示在同一腫瘤細(xì)胞群體中，可能存在某些既能控制腫瘤生長(zhǎng)，又能控制腫瘤轉(zhuǎn)移的同源基因。但目前對(duì)EGFR過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理還了解甚少。曾方銀等［14］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中EGFR過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的黏附作用，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞分解基底膜和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。肌動(dòng)蛋白(actin)修飾蛋白的動(dòng)員是EGFR介導(dǎo)的遷移反應(yīng)所必需的，EGF與EGFR 結(jié)合后，可以激活細(xì)胞骨架，通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架重構(gòu)、黏附、移動(dòng)、表達(dá)和蛋白酶的的活化等多種途徑影響腫瘤的轉(zhuǎn)移性［15］。

多種不同的EGFR信號(hào)傳遞抑制劑，如：IMC C225、ZD1839和OSI2774在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示了抗癌活性，并在初步的臨床試驗(yàn)中取得了令人振奮的結(jié)果。以EGFR為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療有特異、廣譜、高效的特點(diǎn)，已成為癌癥治療的成功領(lǐng)域之一。本實(shí)結(jié)果顯示：CNE-2Z細(xì)胞在不同濃度姜黃素處理24 h后EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)均有不同程度的減少，隨著姜黃素濃度的升高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這表明姜黃素有可能通過(guò)抑制EGFR的表達(dá)來(lái)抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

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Effects of curcumin on invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells

FAN De-sheng, LI Ze-min, SUN Ning(Department of Pathology, Shuguang Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021, China)

SUN Ning E-mail：hellen4099@126.com

Background and purpose：The main causes of nasopharyngeal carcinoma patient’s death are loco-regional recurrence and distant metastasis after radiation therapy. Curcumin, a natural compound extracted from rhizomes of curcuma species, has been shown to possess potent anti-inflammatory, anti-tumor and anti-oxidative properties. This study aimed to explore the effects of curcumin on invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells and to investigate the possible mechanism.Methods：CNE-2Z cells were treated with 10, 20,40 and 80 μmol/L curcumin for 24 and 48 h, respectively. Proliferation of cells was measured by MTT assay. Invasion and metastasis of cells were evaluated with Transwell chamber. The expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) was detected by RT-PCR and Western blot.Results：After being treated with curcumin, the proliferation of CNE-2Z cells was inhibited in a time and dose-depending manner, the invasion and metastasis of cells were also inhibited, and the expression level of EGFR was decreased.Conclusion：Curcumin could decrease the invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells possibly by inhibiting the expression of EGFR.

Nasopharyngeal carcinoma; Curcumin; Invasion; Metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.006

R739.63

A

1007-3639(2011)06-0452-05

廣東省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No：GK0404)。

孫寧 E-mail:hellen4099@126.com

2011-01-12

2011-05-20）