馬小俞 劉哲斌 喻三見 李爽 侯意楓 邵志敏

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

三苯氧胺誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株耐藥及自噬的關(guān)系研究

馬小俞1,2劉哲斌1喻三見1李爽1侯意楓1邵志敏1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

背景與目的：三苯氧胺(tamoxifen)作為第一代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulator，SERM)被廣泛地應(yīng)用于激素敏感型乳腺癌的內(nèi)分泌一線治療。三苯氧胺耐藥的發(fā)生嚴(yán)重限制了臨床治療，是乳腺癌患者用藥面臨的重大難題，明確其耐藥機制對乳腺癌的治療有重要臨床意義。本研究通過體外誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7三苯氧胺耐藥，探討細(xì)胞產(chǎn)生三苯氧胺耐藥時自噬水平的變化與MAPK家族蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白表達(dá)量及磷酸化水平的變化。方法：濃度遞增篩選法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞耐藥，透射電鏡觀察MCF-7細(xì)胞與耐藥細(xì)胞內(nèi)的自噬泡數(shù)量，CCK8法檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)，應(yīng)用Western blot檢測LC3Ⅱ、ERK1/2、Phospho-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：誘導(dǎo)的三苯氧胺耐藥細(xì)胞株TR5達(dá)到5 μmol/L的耐藥濃度。TR5細(xì)胞內(nèi)的自噬泡數(shù)量與LC3Ⅱ表達(dá)量明顯高于MCF-7細(xì)胞。ERK蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但其在TR5中的磷酸化水平比MCF-7細(xì)胞高。結(jié)論：MCF-7三苯氧胺耐藥細(xì)胞有較高的自噬水平，MAPK信號通路參與了三苯氧胺耐藥。

乳腺癌； 三苯氧胺； MCF-7細(xì)胞； 自噬

三苯氧胺(tamoxifen)從20世紀(jì)70年代開始廣泛地應(yīng)用于激素敏感型乳腺癌的內(nèi)分泌一線治療［1］。三苯氧胺通過和雌激素受體(estrogen receptor，ER)競爭性結(jié)合，募集共阻遏因子，減少各種靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到細(xì)胞周期停滯，以致細(xì)胞凋亡的作用［1-2］。

盡管在ER和(或)孕激素受體(progestogen，PR)陽性的初治乳腺癌患者中，三苯氧胺的有效率可達(dá)70%(30%的患者先天耐藥)，但最終50%左右的患者對其產(chǎn)生耐藥(即獲得性耐藥)［3-4］。究其原因可能與以下幾方面有關(guān)：⑴ER和表皮生長因子受體(EGFR和Her-2)及類胰島素生長因子Ⅰ型受體(IGF-1R)之間的交互作用(cross-talk)；⑵雌激素受體β亞型的存在(ERβ)；⑶ER編碼基因的突變或異常磷酸化；⑷Src-Cas-EGFR-STAT5b信號通路的異?；罨?-6］。但是獲得性耐藥的分子機制尚不明確。本研究通過體外誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7三苯氧胺耐藥，比較耐藥株與非耐藥株細(xì)胞的自噬水平與絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)家族蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的表達(dá)水平及磷酸化水平，探討了細(xì)胞產(chǎn)生三苯氧胺耐藥時自噬水平的變化與ERK蛋白表達(dá)量與其磷酸化水平的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞系

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生命化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑

三苯氧胺購于美國Sigma公司，用無水乙醇溶解，配制母液濃度10-2mol/L，-20 ℃保存。雌二醇(E2)購于美國Sigma公司，用無水乙醇溶解，配制母液濃度10-6mol/L，-20 ℃保存。胎牛血清(FBS)購于奧地利PAA公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，活性炭處理去雌激素胎牛血清(CCFBS)購于以色列BioInd公司，CCK8細(xì)胞活性測定試劑盒購于日本同仁化學(xué)公司，蛋白定量試劑盒購于申能博彩生物科技有限公司，LC3B抗體購于美國Genetex公司，ERK1/2抗體、兔抗Phospho-ERK1/2抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，哺乳動物蛋白抽提試劑、鼠抗GAPDH鼠單克隆抗體、辣根過氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG購于北京康為世紀(jì)公司，HRP和AP化學(xué)發(fā)光檢測底物購于美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度，待細(xì)胞達(dá)到80%生長面積時，0.25%胰酶消化，每2天更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞透射電鏡觀察

2.2.2 原料秸稈規(guī)模化利用不足 為了促進(jìn)企業(yè)增加對秸稈資源的利用，擴大生產(chǎn)規(guī)模，就必須讓其有利可圖。目前大多數(shù)企業(yè)受秸稈收集難度大、運輸成本高和生產(chǎn)技術(shù)技術(shù)的制約，使得對秸稈綜合利用率和生產(chǎn)規(guī)模較低，從而秸稈資源大量的過剩。而農(nóng)民因顧及時間、人力、機器使用成本，也會影響到對秸稈進(jìn)行打捆，獲得收入。

細(xì)胞傳代貼壁后，換成含CCFBS的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后加入10-9mol/L E2培養(yǎng)12 h，在培養(yǎng)液里滴加2～3滴固定液(2.5%戊二醛)，用細(xì)胞刮輕輕的刮下貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞連同培養(yǎng)液放入尖頭離心管中離心5 min，3 000 r/min，離心半徑16 cm，去上清液，沿管壁輕輕滴入2.5%戊二醛，微波中檔固定5～10 s后，置4 ℃下固定1 h，用帶鉤的解剖針勾出細(xì)胞團塊，切成1 mm3大小的組織塊。

組織塊具體處理過程如下：取材→前固定(2.5%戊二醛，4 ℃冰箱，2 h以上)→漂洗(0.1 mol/L磷酸緩沖液，3次，每次15 min)→后固定(1%鋨酸2 h) →漂洗(0.1 mol/L磷酸緩沖液，3次，每次15 min)→脫水(50%乙醇，3次，每次15 min)→塊染(70%乙醇含3%醋酸鈾過夜)→梯度脫水(90%乙醇，90%乙醇∶90%丙酮=1∶1，90%丙酮各15 min)→室溫100%丙酮酮脫水(3次，每次15 min)→包埋(純丙酮∶包埋液=1∶1，室溫過夜；純包埋液37 ℃ 烘箱 3 h)→固化(45 ℃ 烘箱6 h，60 ℃ 烘箱24 h)。

用LKB-1型超薄切片機切片，每個樣品大概50～60 nm的厚度，然后用枸櫞酸鉛進(jìn)行片染色，最后用日本電子JEM-1200EX透射電鏡觀察并拍片。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖率測定

制備細(xì)胞懸液，血細(xì)胞計數(shù)板細(xì)胞計數(shù)。懸浮細(xì)胞密度為6 000/mL，加入96孔板，每孔板加200 μL，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，加入含10% CCFBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再加用10% CCFBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(含10-9mol/L E2)稀釋不同濃度(分別為0、10-7、10-6和10-5mol/L)的三苯氧胺溶液，每一濃度做3個復(fù)孔，對照孔加入等體積的培養(yǎng)基。加入后37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm光吸光度值(D)，計算出增殖率，繪制曲線。細(xì)胞增殖率計算方式如下：

1.2.4 Western blot方法檢測蛋白表達(dá)

細(xì)胞傳代貼壁后，換成含10% CCFBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再分別加入含10-9mol/L E2和10-9mol/L E2+10-5mol/L三苯氧胺培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次，用哺乳動物蛋白抽提試劑裂解細(xì)胞，將內(nèi)容物移入離心管，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，上清置-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ玫鞍锥吭噭┖袦y定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad 5.0軟件、SPSS 13.0軟件和Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖。每次實驗隨機獨立重復(fù)3次，所有作圖和數(shù)據(jù)表中數(shù)據(jù)由表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 濃度遞增篩選法體外誘導(dǎo)三苯氧胺耐藥株TR5

細(xì)胞傳代貼壁后，用10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋的濃度為1 μmol/L三苯氧胺溶液持續(xù)培養(yǎng)，在這過程中有死亡細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基，待細(xì)胞達(dá)到80%左右生長面積時，消化傳代，待貼壁后，加入含同樣濃度三苯氧胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到細(xì)胞再次達(dá)到80%左右生長面積時幾乎無死亡細(xì)胞懸浮，此時可認(rèn)為細(xì)胞適應(yīng)了這個濃度，有持續(xù)的活性并且能穩(wěn)定的增殖，這樣得到了耐藥株細(xì)胞TR1。冷凍保存一部分，然后對TR1繼續(xù)提高濃度到2 μmol/L三苯氧胺誘導(dǎo)，同樣直到細(xì)胞適應(yīng)這個濃度，此時的細(xì)胞為TR2。以此類推，誘導(dǎo)出了耐藥細(xì)胞TR3、TR4和TR5 (圖1)。在上述篩選過程中，三苯氧胺每提高一個濃度時，都約有20%細(xì)胞死亡，TR5細(xì)胞株是耐藥能力最強。

在光學(xué)顯微鏡下觀察，我們發(fā)現(xiàn)TR5細(xì)胞在形態(tài)上與MCF-7細(xì)胞有所差異，TR5細(xì)胞有較多的分支且分支較長(圖1)。

2.2 乳腺癌細(xì)胞MCF-7與三苯氧胺耐藥細(xì)胞TR5對三苯氧胺敏感性

在4種不同濃度的三苯氧胺作用48 h后，結(jié)果顯示隨著三苯氧胺濃度的升高，MCF-7與TR5細(xì)胞增殖率均降低，在對照組不加三苯氧胺的情況下，MCF-7的增殖率為76.3%，而TR5達(dá)到了260%，是MCF-7細(xì)胞的3.4倍，三苯氧胺濃度分別在10-7和10-6mol/L濃度時，TR5的增殖率是MCF-7的3.4和3.5倍。在相對較高濃度10-5mol/L的三苯氧胺處理時，TR5細(xì)胞的增殖率達(dá)到了MCF-7的8.8倍(圖2)。三苯氧胺的濃度越高，耐藥細(xì)胞TR5與非耐藥MCF-7細(xì)胞對三苯氧胺敏感性差異越大。以上兩組細(xì)胞在同一濃度三苯氧胺處理時，增殖率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 MCF-7與耐藥株TR5中自噬水平的比較

透射電鏡觀察到在TR5細(xì)胞中有較多自噬泡(白色箭頭所指)，而在MCF-7細(xì)胞中幾乎未看到自噬泡，其中N是細(xì)胞核，V是線粒體(圖3A)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，耐藥株TR5細(xì)胞中平均每個細(xì)胞中自噬泡數(shù)量可達(dá)15個左右，而平均每個非耐藥株細(xì)胞MCF-7中只有1～2個自噬泡(圖3A)。

Western blot檢測LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示加入三苯氧胺后，MCF-7與TR5自噬蛋白水平均升高，耐藥細(xì)胞TR5在E2與E2+三苯氧胺組中的LC3 Ⅱ表達(dá)量均顯著高于MCF-7(圖3B)。

2.4 人乳腺癌MCF-7與耐藥細(xì)胞TR5的ERK1/2蛋白表達(dá)及磷酸化水平

加入三苯氧胺后，兩種細(xì)胞的ERK1/2蛋白表達(dá)水平未見變化，但Phospho-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均上升，即ERK1/2蛋白磷酸化水平升高。在E2組，TR5細(xì)胞中的Phospho-ERK1/2達(dá)到了MCF-7細(xì)胞的9倍；加入了TAM后，TR5中Phospho-ERK蛋白水平也明顯高于MCF-7細(xì)胞(圖 4)。

3 討 論

本研究用濃度遞增篩選法體外誘導(dǎo)出三苯氧胺耐藥細(xì)胞，類似的方法也被用來建立耐4-羥基三苯氧胺MCF-7耐藥株［7-8］。自噬對腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)和抑制的雙重作用，一方面自噬在抵御環(huán)境變化對細(xì)胞造成損傷的過程中起著重要的保護作用［9-10］，另一方面在某些情況下，例如細(xì)胞的凋亡機制有所缺陷時，自噬也可以促進(jìn)細(xì)胞死亡［10］。在篩選過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞把自噬作為一種保護自身的機制得以存活，并且直到適應(yīng)了三苯氧胺濃度后才能進(jìn)行增殖。阻斷自噬可成為克服乳腺癌細(xì)胞對三苯氧胺耐藥的一種新策略。

絲裂原活化蛋白激酶通路之一的ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨軌?qū)е录?xì)胞喪失凋亡和分化的能力，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，異常增殖，產(chǎn)生腫瘤，并能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［11］。

有研究報道，乳腺癌患者中產(chǎn)生三苯氧胺耐藥與MAPK家族蛋白的表達(dá)有關(guān)［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)耐藥株細(xì)胞中，MAPK家族蛋白ERK磷酸化水平明顯高于非耐藥株細(xì)胞。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的持續(xù)激活可促進(jìn)細(xì)胞周期素D1的表達(dá)及其與細(xì)胞周期依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［14］，這與本研究結(jié)果耐藥細(xì)胞增殖率明顯高于非耐藥細(xì)胞是相符的，同時也說明MAPK信號通路參與了細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生。抑制ERK蛋白磷酸化使其失活可成為阻礙細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的一種新方法，并且參與ERK信號通道的各級分子都有可能成為治療乳腺癌的潛在靶分子，這不僅為乳腺癌的內(nèi)分泌治療提供潛在的作用靶點，而且為新的內(nèi)分泌治療模式提供了一定的理論基礎(chǔ)。

［1］JORDAN V C, O’MALLEY B W. Selective estrogen-receptor modulators and antihormonal resistance in breast cancer［J］. J Clin Oncol, 2007, 25: 5815-5824.

［2］CARROLL J S, BROWN M. Estrogen receptor target gene:an evolving concept ［J］. Mol Endocrinol, 2006, 20: 1707-1714.

［3］CAMPBELL F C, BLAMEY R W, ELSTON C W, et al.Quantitative oestradiol receptor values in primary breast cancer and response of metastases to endocrine therapy ［J］.Lancet, 1981, 2: 1317-1319.

［4］JAIYESIMI I A, BUZDAR A U, DECKER D A, et al. Use of tamoxifen for breast cancer: twenty-eight years later ［J］. J Clin Oncol, 1995, 13: 513-529.

［5］MASSARWEH S, SCHIFF R. Resistance to endocrine therapy in breast cancer: exploiting estrogen receptor/growth factor signaling crosstalk ［J］. Endocr Relat Caner, 2006, 13: S3-S13.

［6］RIGGINS R B, SCHRECENGOST R S, GUERRERO M S, et al. Pathways to tamoxifen resistance ［J］. Cancer Lett, 2007,256: 1-24.

［7］SCHOENLEIN P V, PERIYASAMY-THANDAVAN S,SAMADDAR J S, et al. Autophagy facilitates the progression of ERalpha-positive breast cancer cells to antiestrogen resistance ［J］. Autophagy, 2009, 5: 400-403.

［8］GADDY V T, DUPLANTIER J, THANDAVAN S P,et al. A role for macroautophagy in protection against 4-hydroxytamoxifen-induced cell death and the development of antiestrogen resistance ［J］. Mol Cancer Ther, 2008, 7:2977-2987.

［9］FERRARO E, CECCONI F. Autophagic and apoptotic response to stress signals in mammalian cells ［J］. Arch Biochem Biophys, 2007, 462: 210-219.

［10］YOSHIMORI T. Autophagy: paying charon’s toll ［J］. Cell,2007, 128: 833-836.

［11］ADEYINKA A, NUI Y, CHERLET T, et al. Activated mitogen-activated protein kinase expression during human breast tumorigenesis and breast cancer progression ［J］.Clin Cancer Res, 2002, 8: 1747-1753.

［12］CUI Y, PARRA I, ZHANG M, et al. Elevated expression of mitogenactivated protein kinase phosphatase 3 in breast tumors: Amechanism of tamoxifen resistance ［J］. Cancer Res, 2006, 66: 5950-5959.

［13］GUTIERREZ M C, DETRE S, JOHNSTON S, et al. Molecular changes in tamoxifen-resistant breast cancer: relationship between estrogen receptor, HER-2, and p38 mitogenactivated protein kinase ［J］. J Clin Oncol, 2005, 23: 2469-2476.

［14］FIDDES R J, JANES P W, SIVERTSEN S P, et al. Inhibition of the MAP kinase cascade blocks heregulin-induced cell cycle progression in T-47D human breast cancer cells ［J］.Oncogene, 1998, 16: 2803-2813.

Studies on resistant induction of breast cancer cell MCF-7 to tamoxifenin vitro

MA Xiao-yu,LIU Zhe-bin, YU San-jian, LI Shuang, HOU Yi-feng, SHAO Zhi-min(Department of Breast Surgery, Cancer Hospital, Fudan University; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

HOU Yi-feng E-mail：yifenghoupitt@yahoo.com

Background and purpose：Tamoxifen (TAM), the pioneering selective estrogen receptor modulator (SERM), which blocks estrogen action by binding to the ER in breast cancers, has been used ubiquitously for endocrine therapy for the hormone-sensitive breast cancer. Intrinsic and acquired resistance to TAM limits the clinical use of TAM to a narrow therapeutic window and they are big challenges to the drug therapy for breast cancer patients.Better understanding of the TAM resistant mechanisms is therefore of considerable clinical significance. In our study,we induced breast cancer cell MCF-7 resistant to TAMin vitroand tried to explore the changes of autophagic levels and the expression of ERK (extracellular signal-regulated kinase, one of MAPK family proteins) and Phospho-ERK1/2 in TAM resistant cells compared with MCF-7 cells.Methods：Stepwise TAM selection was used to establish the TAM resistant TR5 subline. Autophagic vacuoles in cells were observed by means of transmission electron microscopy. The growth of the two cell lines were measured by CCK8, and the expression of LC3 Ⅱ, ERK1/2 and Phospho-ERK1/2 were measured by Western blot.Results：The TAM resistant cell line TR5 we established can be resistant to 5 μmol/L TAM. The number of autophagic vacuoles and the expression of LC3 Ⅱ protein in TR5 were obviously higher than that in MCF-7. There was no significant difference in the protein expression level of ERK1/2 between MCF-7 and TR5 cells, but the level of Phospho-ERK1/2 was markedly higher in TR5 cells than that in MCF-7 cells.Conclusion：TAM resistant MCF-7 cells have relatively high autophagic level and MAPK pathway is involved in facilitating TAM resistance.

book=422,ebook=298

Breast cancer; Tamoxifen; MCF-7; Autophagy

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.001

R737.9

A

1007-3639(2011)06-0421-06

上海市科委浦江人才計劃(No：09PJ1402700)；國家自然科學(xué)基金(No：81072165)。

侯意楓 E-mail:yifenghoupitt@yahoo.com

2011-03-24

2011-05-20）