張曉丹， 蔡瑞雪， 呂高照， 曲彩霞

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076;2.哈爾濱市紅十字醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150076)

阿霉素(Adriamycin，Adr)是一種高效的廣譜抗腫瘤藥物，該藥抗瘤譜廣、療效顯著。自1970年用于臨床治療腫瘤以來(lái)［1］，被認(rèn)為是治療實(shí)體腫瘤最有效的藥物。但是因其嚴(yán)重的心臟毒性限制了它在臨床上的應(yīng)用［2－3］。研究表明，心肌線粒體是其主要的毒性靶點(diǎn)之一［4－7］。?；撬?Taurine，Tau)從發(fā)現(xiàn)至今已有160多年的歷史，因1827年首次從牛膽汁中分離出而得名［8］。研究表明，Tau的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用和膜穩(wěn)定作用可保護(hù)線粒體膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化，保持線粒體膜的完整性，從而維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定［9］。心肌線粒體損傷是 Adr引起心臟毒性發(fā)生的主要標(biāo)志，而Tau能否通過(guò)對(duì)心肌線粒體的影響而減緩 Adr引起的心臟毒性，目前還未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討Tau對(duì)Adr所致大鼠心肌線粒體損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，180～220g/只，共40只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京2007－0001)。

1.1.2 藥品與試劑 Tau(上海生物化學(xué)試劑公司提供，純度＞99%);阿霉素由深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H44024359;Rhodamine123購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，分析純;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 JEM2100CXⅡ透射電鏡(日本電子公司);2100MP激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司);Langendorff灌流系統(tǒng)(美國(guó)Radnoti公司);RF25210熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 健康Wistar大鼠40只，♀♂各半，隨機(jī)分成5組，每組8只。(1)Adr組:于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第2、4天腹腔注射Adr 1 mg/kg，第6、8天腹腔注射 Adr 2 mg/kg，第10、12天腹腔注射Adr 3 mg/kg，第 14、16 天腹腔注射 Adr 4 mg/kg，16天累計(jì)用藥劑量達(dá) 20 mg/kg［10－11］。(2)Adr+TauⅠ組:Tau 灌胃給藥［12－13］灌胃給藥 100 mg/(kg·d);(3)Adr+TauⅡ組:Tau灌胃給藥200 mg/(kg·d);(4)Adr+TauⅢ組:Tau灌胃給藥400 mg/(kg·d)。各組Tau于實(shí)驗(yàn)第一天起開(kāi)始給藥，每日灌胃1次，連續(xù)16 d，同時(shí)，Adr的給藥時(shí)間、給藥劑量、給藥次數(shù)同Adr組。Tau灌胃給藥是在腹腔注射Adr前30min;(5)陰性對(duì)照組:實(shí)驗(yàn)處理同Adr組，腹腔注射等劑量生理鹽水。

1.2.2 心肌組織的電鏡觀察 大鼠處死后，迅速取出心臟，在心尖處取約1 cm3的心肌組織，用2.5%的戊二醛固定，再經(jīng)漂洗、脫水、浸透、包埋、切片、染色后進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.3 心肌細(xì)胞Ca2+濃度的測(cè)定 動(dòng)物脫臼處死，取出心臟，置預(yù)冷的50 mol/L Tris－HCl緩沖液沖洗，剪碎，制備勻漿，過(guò)濾，離心，棄上清，沉淀用緩沖液復(fù)溶后再次離心同前，所得沉淀用緩沖液調(diào)整蛋白濃度值為0.8 g/L，考馬斯亮蘭法測(cè)定膜懸液［14］蛋白濃度，新鮮即用。取穩(wěn)定好的細(xì)胞，離心，去上清后，用無(wú)鈣臺(tái)氏液洗滌，然后用Fluo－3AM染色，終濃度為2 μg/mL，避光，在37℃恒溫水浴中孵育0.5 h，離心，用KB液洗滌，將細(xì)胞稀釋?zhuān)湃?00～300 μL的浴槽。將Fluo－3AM負(fù)載好的細(xì)胞在激光掃描共聚焦顯微鏡下掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，放射波長(zhǎng)526 nm，其熒光值與［Ca2+］i正相關(guān)，即以熒光值(FI)變化表示［Ca2+］i變化。

1.2.4 心肌線粒體膜電位的測(cè)定

1.2.4.1 心肌線粒體的制備［15］將大鼠饑餓處理多于12 h以上，以去除心肌組織內(nèi)的糖元和脂肪;斷頭處死大鼠，取下心臟，剝離瓣膜，擠去心臟中的血液，放于冷的蒸餾水中洗去血液;迅速浸入0℃的勻漿介質(zhì)中(勻漿介質(zhì)的成分mmol/L:甘露醇225，蔗糖75，EDTA 1和0.25%的牛血清白蛋白，pH 7.4)。用組織剪將心肌剪成米粒樣大小，同時(shí)去除脂肪和結(jié)締等組織。將剪碎的心肌和勻漿液倒入勻漿管中，在冰浴下進(jìn)行勻漿，進(jìn)行20 min，勻漿基本徹底。按照差速離心法分離線粒體。采用考馬斯亮蘭法測(cè)定線粒體蛋白含量，調(diào)整線粒體蛋白濃度為1 mg/mL。

1.2.4.2 膜電位的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［16］將反應(yīng)介質(zhì)(蔗糖150 mmol/L，氯化鎂5 mmol/L，琥珀酸鈉5 mmol/L，魚(yú)藤酮 2.5 mmol/L，Hepes 20 mmol/L)加入到各組線粒體懸液中，濃度為26 μmol/L的Rhodanmine123，室溫下反應(yīng)5 min;Rh123的激發(fā)波長(zhǎng)為503 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm的條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較用單因素方差分析(one－way ANOVA)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 Tau對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 見(jiàn)圖1。從圖中可見(jiàn):A.陰性對(duì)照組:心肌細(xì)胞完整，肌原纖維排列整齊，心肌纖維紋理清晰。線粒體結(jié)構(gòu)清晰，膜較完整，基質(zhì)清楚。B.Adr組:肌原纖維排列紊亂，肌纖維斷裂;線粒體腫脹出現(xiàn)空泡變，內(nèi)腔擴(kuò)大，膜模糊不清;嵴排列稀疏，有斷裂，肌節(jié)消失。C.Adr+TauⅠ組:對(duì)心肌保護(hù)作用較小，線粒體腫脹輕微減輕，但仍有空泡變出現(xiàn)，嵴仍有改變。D.Adr+TauⅡ組:心肌纖維腫脹進(jìn)一步減輕，仍有個(gè)別線粒體出現(xiàn)輕度腫脹，肌節(jié)斷裂減少。E.Adr+TauⅢ組:心肌顯微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，線粒體腫脹減輕，結(jié)構(gòu)較完整，嵴排列較整齊、致密，基本接近陰性對(duì)照組。

圖1 Tau對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of Tau on ultrastructure of cardiac muscle cell in electron microscope

2.2 Tau對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+含量及線粒體膜電位的影響 由表1可知:與陰性對(duì)照組相比，Adr組Ca2+濃度明顯升高，TauⅢ組能使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯下降(P＜0.01)，TauⅡ組能使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著降低(P＜0.05)，TauⅠ組心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P＜0.05)。說(shuō)明TauⅢ組能降低心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，緩解鈣超載。而與陰性對(duì)照組相比，Adr組心肌線粒體膜電位顯著下降(P＜0.05);給予Tau可使線粒體膜電位升高，TauⅡ、Ⅲ組可明顯升高心肌線粒體膜電位(P＜0.05)，提示Tau可明顯減輕Adr所致的大鼠心肌線粒體損傷。

表1 Tau對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+含量、線粒體膜電位的影響(n=8，±s)Tab.1 Effects of Tau on the［Ca2+］i and MMP of myocardial mitochondria(n=8，±s)

表1 Tau對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+含量、線粒體膜電位的影響(n=8，±s)Tab.1 Effects of Tau on the［Ca2+］i and MMP of myocardial mitochondria(n=8，±s)

與陰性對(duì)照組比較*P＜0.05，與Adr組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。*P ＜0.05 **P ＜0.01 vs.Normal△P ＜0.05 △△P ＜0.01 vs.ADR group

組別 劑量/(mg/kg) Ca2+熒光值－ 23.35±4.41 144.82±34.25 Adr組 － 31.84±5.06* 102.56±31.77*Adr+TauⅠ組 100 34.58±2.32 116.10±27.56 Adr+TauⅡ組 200 25.66±0.40△ 133.37±33.61△Adr+TauⅢ組 400 21.11±2.50△△ 141.07±29.12膜電位熒光強(qiáng)度陰性對(duì)照組△

3 討論

自從1973年Lefrak首次報(bào)告了Adr心臟毒性，認(rèn)為它比骨髓抑制作用、消化道和腎臟毒性等更為危險(xiǎn)，由于心臟毒性而限制其作用。因此越來(lái)越多的學(xué)者就Adr引起的心臟毒性而進(jìn)行了研究。研究認(rèn)為，目前對(duì)Adr心肌毒性的機(jī)制尚未徹底清楚，可能包括自由基、鈣超載、細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等多因素共同作用的結(jié)果，多因素之間互相聯(lián)系、互為因果，形成Adr心臟毒性的惡性網(wǎng)絡(luò)，共同導(dǎo)致心臟毒性的發(fā)生和發(fā)展［17］。本實(shí)驗(yàn)就Adr可能產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行了研究，并從該機(jī)制著手，觀察了Tau對(duì)Adr大鼠心臟毒性的影響。

Adr引起心臟毒性的可能機(jī)制有:鈣超載和線粒體損傷。正常心肌細(xì)胞中Ca2+大部分儲(chǔ)存于線粒體、肌漿網(wǎng)及肌膜上。Adr能破壞心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，影響膜的滲透性刺激線粒體和肌漿網(wǎng)，將Ca2+釋放至胞質(zhì)，加重 Ca2+超載［18］。線粒體在心肌細(xì)胞的能量代謝中起重要作用，其攝取Ca2+的速度很慢，但存儲(chǔ)量很大，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的主要細(xì)胞器之一。研究表明Adr通過(guò)一種特異性的線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)阻滯劑環(huán)孢菌素A作用于鈣釋放通道而破壞線粒體內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)作用［19］。大量證據(jù)表明，在Adr引起的心臟毒性發(fā)病過(guò)程中，線粒體是主要靶向器官。Adr心臟毒性時(shí)產(chǎn)生大量氧自由基，線粒體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)使線粒體受損，極容易發(fā)生線粒體功能障礙。Ca2+的蓄積與線粒體損傷，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成減少。Adr還可使線粒體的NADH脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、細(xì)胞色素還原酶及琥珀酸脫氫酶的活性降低，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成障礙，嚴(yán)重影響心肌的收縮和舒張功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Adr組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改變，表現(xiàn)為線粒體彌漫性腫脹，內(nèi)腔擴(kuò)大，空泡變。Adr可使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，加重鈣超載，也可顯著降低線粒體膜電位。說(shuō)明Adr所致心臟毒性模型制備成功，提示線粒體損傷可能是阿霉素引起心臟毒性的主要機(jī)制。上述結(jié)果表明大劑量的Tau可改善Adr所致的大鼠心肌線粒體的病理改變，減輕鈣超載，提高線粒體膜電位。說(shuō)明Tau有可能是通過(guò)減緩鈣超載及減輕線粒體損傷來(lái)防治Adr所致的心臟毒性。小劑量的Tau輕微的減輕線粒體損傷，但加重了鈣超載，對(duì)心臟毒性并不能起有效的防治作用。

綜上所述，大劑量Tau可以非常顯著的改善線粒體損傷，鈣超載及提高膜電位，且無(wú)毒副作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還證明了小劑量Tau不適用于防治Adr所致的心臟毒性。目前隨著Adr在腫瘤治療領(lǐng)域中具有不可替代的作用，其心臟毒性也越來(lái)越受到人們的重視。Tau能有效的防護(hù)心腦毒性［20］，為臨床應(yīng)用Adr后的心肌保護(hù)性輔助用藥提供了治療策略。

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