王 巍, 鞠成國, 朱 旭, 趙煥君
(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧大連 116600;2.沈陽南六成大方圓醫(yī)藥有限公司,遼寧沈陽 110005)
急性子為鳳仙花科植物鳳仙花Impatiens balsaminaL.的干燥成熟種子[1],始載于《救荒本草》,具有破血軟堅,消積的功效,用于治療癥瘕痞塊,經(jīng)閉,噎膈。據(jù)文獻(xiàn)報道急性子中含有黃酮類、皂苷類、脂肪油等化合物[2-7],其中所含的黃酮類化合物具有多種生物活性,除抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿等作用外,在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有顯著效果[8]。本試驗采用HPLC法,建立急性子中黃酮類成分的指紋圖譜[9-11],并對 11 個不同產(chǎn)地藥材的相似性進(jìn)行分析。
電子天平(FA1004B),超聲波清洗器(SB5200D),紫外-可見分光光度計(日立U3010),高效液相色譜儀(Agilent 1100系列);槲皮素(100080-200406)、山 柰 酚 (0861-200002)、蘆 丁(100080200306)購自中國藥品生物制品檢定所;急性子藥材分別于2008年11月收集于江蘇無錫(S1)、安徽六安(S2)、福建三明(S3)、遼寧撫順(S4)、安徽亳州(S5)、河北安國(S6)、河南鄭州(S7)、遼寧沈陽(S8)、蘇州太湖(S9)、云南昆明(S10)、浙江杭州(S11),經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為鳳仙花科植物鳳仙花Impatiens balsaminaL.的干燥成熟種子。
2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil TM C18柱(250 mm ×4.6mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0 min:35%A;15 min:45%A;30 min:60%A;45 min:75%A;50 min:100%A);檢測波長:365 nm;柱溫:30℃;流速:1.0 ml/min。
2.2 供試品溶液制備 取急性子藥材炒黃,破碎,取粉末5 g,精密稱定,置具塞三角瓶中;加入乙醚30 mL,超聲處理20 min,棄去乙醚液,水浴揮散乙醚至藥渣無醚味;精密加入70%甲醇40 mL,稱重,超聲處理40 min,取出,放涼,稱重(必要時補足所失重量),濾過,取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過,濾液備用。
2.3 對照品溶液制備 分別精密稱取槲皮素、山柰酚和蘆丁對照品適量,加甲醇制成濃度為0.005 56 mg/mL、0.002 42 mg/mL 和 0.017 2 mg/mL 的溶液,備用。
2.4 測定方法 分別精密吸取不同產(chǎn)地供試品溶液及對照品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀,測定。
2.5 HPLC指紋圖譜的建立
2.5.1 共有峰的確定 以槲皮素色譜峰為參照,確定其相對保留時間為1,計算其它色譜峰的相對保留時間,標(biāo)定出12個共有峰,結(jié)果見表1。指紋圖譜見圖1。經(jīng)與對照品相比較,確定9號共有峰為蘆丁,12號共有峰為山柰酚。11個不同產(chǎn)地急性子藥材指紋圖譜疊圖見圖2。
表1共有峰的相對保留時間Tab.1 Relative retention time of common peaks
圖1 急性子藥材HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Impatientis Semen
2.5.2 共有峰相對峰面積 以槲皮素色譜峰面積作為1,計算其它各共有峰的相對峰面積。結(jié)果不同樣品共有峰相對峰面積差異較大,表明不同地區(qū)的急性子藥材質(zhì)量之間存在較大差別。結(jié)果見表2。
2.5.3 共有峰面積 對11個不同產(chǎn)地藥材的色譜峰面積進(jìn)行統(tǒng)計,計算各自共有峰面積占總峰面積的百分比,結(jié)果在90.3% ~94.8%之間,符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的相關(guān)規(guī)定。結(jié)果見表3。
圖2 11個產(chǎn)地急性子藥材HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint for 11 different habitats of Impatientis Semen
2.6 方法學(xué)考察
2.6.1 精密度考察 取同一份供試品溶液(S11),連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間RSD<0.8%,相對峰面積RSD<1.0%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。
表2共有峰的相對峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks
表3 共有峰面積百分比Tab.3 Percentage of the common peak areas
2.6.2 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(S11),分別在 0、2、4、8、16、24 h 測定,記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間RSD<1.2%,相對峰面積RSD<1.6%。結(jié)果表明,24 h內(nèi)測定,樣品穩(wěn)定性良好。
2.6.3 重復(fù)性考察 取急性子藥材(S11)5份,按2.2項下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)行測定。各共有峰的相對保留時間RSD<1.1%,相對峰面積RSD<2.0%。結(jié)果表明,方法重復(fù)性良好。
2.7 相似度評價[12]采用平均矢量法對11個不同產(chǎn)地的急性子藥材指紋圖譜建立共有模式,作為對照指紋圖譜,將每張指紋圖譜與其進(jìn)行比較,得到各譜與對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果見表4。試驗結(jié)果提示,S1~S5和S7~S11與對照圖譜的相似度均達(dá)到0.9以上,符合要求。S6和S7與對照圖譜的相似度為0.85,小于0.9,但由性狀鑒別無法否定其為急性子藥材,因此有待于進(jìn)一步采用化學(xué)模式識別方法作進(jìn)一步評價。
表4相似度考察Tab.4 Investigation of similarity
3.1 提取溶劑考察 鑒于黃酮類成分在一定濃度的醇水中溶解度較大,因而本試驗擬采用甲醇為溶媒,分別對甲醇、70%甲醇、50%甲醇的提取情況進(jìn)行考察。試驗結(jié)果提示,甲醇提取的樣品色譜圖中,色譜峰個數(shù)較少,峰面積小,表明提取效率較低,可能因為急性子中黃酮類成分主要以苷的形式存在;70%甲醇提取的樣品色譜圖中,色譜峰個數(shù)較多,峰面積較大;50%甲醇提取的樣品色譜圖中,色譜峰較70%甲醇提取時峰面積小,靈敏度相對較低。因而確定70%甲醇為提取溶劑。
3.2 超聲提取時間考察 超聲提取操作簡單,提取效率高,適于對大量樣本的提取,因而本試驗采用超聲提取的方法制備供試品溶液,并對超聲提取時間進(jìn)行考察。試驗結(jié)果提示,超聲提取40 min后,色譜峰數(shù)目及色譜峰面積基本穩(wěn)定。
3.3 色譜條件選擇考察
3.3.1 檢測波長的選擇 試驗中對槲皮素、山柰酚、蘆丁進(jìn)行紫外全波長掃描,綜合它們最大吸收情況,分別在260 nm和365 nm下檢測。試驗結(jié)果提示,檢測波長為365 nm時的色譜峰數(shù)目明顯多于260 nm,并且靈敏度較高,因此確定365 nm為檢測波長。
3.3.2 流動相的選擇 試驗中分別對甲醇-水、甲醇-磷酸三乙胺水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液不同梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行篩選。最后確定流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液,按前述系統(tǒng)梯度洗脫,各色譜峰分離較好。
急性子藥材目前臨床應(yīng)用較少,但從文獻(xiàn)報道來看,其在治療食道癌方面確有獨到之處。由于《中國藥典》對急性子藥材尚無定性、定量檢查方法,本試驗采用HPLC法建立急性子中黃酮類成分指紋圖譜,旨在為急性子藥材的質(zhì)量控制提供試驗依據(jù)。試驗結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好,可操作性強,可用于對急性子藥材的定性鑒別。試驗中發(fā)現(xiàn),標(biāo)定的各共有峰相對色譜峰面積相差較大,考慮應(yīng)與藥材的生長環(huán)境有關(guān),在臨床應(yīng)用中,為保證其療效的穩(wěn)定,應(yīng)對藥材的產(chǎn)地進(jìn)行規(guī)定,這也是實行中藥GAP的意義所在。試驗中對部分指紋峰進(jìn)行了歸屬,下一步會對其含量進(jìn)行測定,建立急性子藥材中黃酮類成分的質(zhì)量控制方法,而該類成分與療效的關(guān)系則有待于進(jìn)一步的研究。
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