林婉揮，黃華品，林明星，陳圣根

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350001)

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高，近30%發(fā)展為難治性癲癇。其中一部分病人可通過手術(shù)獲得明顯效果，但仍有一部分病人不適合手術(shù)治療或者手術(shù)治療無效。而腦深部電刺激(deep brain stimulation，DBS)用來治療頑固性癲癇已有較長的歷史，其治療結(jié)果令人鼓舞。其主要的刺激靶點有小腦、丘腦中央中核、丘腦底核(subthalanuc nucleus，STN)、丘腦前核、尾狀核、蒼白球、海馬、皮質(zhì)局限性病灶等，其中STN備受關(guān)注。近期，Handforth等[1]研究發(fā)現(xiàn)，給予雙側(cè)丘腦底核電刺激可以減少部分性癲癇患者的發(fā)作頻率和緩解發(fā)作程度，但不能阻止癲癇發(fā)作所致的繼發(fā)性損傷，與抗癲癇藥物的療效相比，并無明顯優(yōu)越性。因此有必要尋找其他刺激部位以提高療效。通常認為丘腦是大腦皮質(zhì)興奮的起搏器，而顳葉癲癇的海馬異常放電可引起丘腦的異常電活動，并向上傳播使大腦皮質(zhì)異常放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。電刺激邊緣系統(tǒng)已經(jīng)成功的應(yīng)用于治療顳葉癲癇病人，同樣也能控制癲癇動物模型的發(fā)作[2]。其可能的機制是高頻電刺激海馬抑制了興奮性氨基酸神經(jīng)元的輸出，阻止了丘腦向大腦皮質(zhì)的異常放電的傳播，即通過調(diào)節(jié)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的平衡起到治療顳葉癲癇的作用[3]。

本實驗在觀察高頻電刺激海馬對海人酸致癇大鼠癲癇發(fā)作影響的同時，利用腦微透析技術(shù)聯(lián)合高效液相分析技術(shù)動態(tài)監(jiān)測海馬細胞外液谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)的濃度變化，以探討高頻電刺激海馬治療癲癇可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

SD清潔級雄性成年大鼠40只，體質(zhì)量200～250g，2個月齡，購自中國上海斯萊克實驗動物有限公司，12 h光照12 h黑暗交替，自由攝取食物和水。海人酸、Glu標準品、GABA 標準品、EDTA、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇(均購自美國Sigma公司)，甲醇為色譜醇(德國Merk公司)。

1.2 癲癇模型的建立

將動物先分成兩大組:空白組(10只)、海人酸組(30只)。海人酸組予腹腔注射海人酸(10mg/kg)，30min后如無Ⅳ級(按Racine分級標準[4])以上發(fā)作，每隔15 min注射1 mg/kg追加劑量，直至出現(xiàn)3次Ⅳ級以上發(fā)作方認為癲癇模型成功。注射后14天內(nèi)利用視頻腦電儀(型號KT-88-2400，北京康泰)大鼠行為學(xué)和皮層腦電圖變化?？瞻捉M則予海人酸相同體積量生理鹽水腹腔注射。

1.3 植入刺激電極

海人酸組隨機分為3組(n=10):海人酸組未予其他處理，假刺激組予植入刺激電極但未刺激，電刺激組。10%水合氯醛(2 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，在腦立體定位儀(Stoelting公司)的幫助下將同心圓式自制電極緩慢插入右側(cè)海馬(前囟后4.8 mm，矢狀右旁開5.2 mm，水平面下7.0mm，前后囟距離9.0mm)，牙托粉固定。連接YC-2型程控電刺激器(成都儀器廠)，模型制作成功后予進行電刺激，每天至少30min，直至癲癇波明顯減少，刺激參數(shù):強度100UA ，波寬60US，頻率130Hz。

1.4 腦微透析方法的建立

在腦立體定位儀的幫助下將微透析引導(dǎo)管植入右側(cè)海馬(前囟后4.8 mm，矢狀右旁開5.0mm，水平面下4.6 mm，)，套上項圈，術(shù)后置于單籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d開始微透析實驗:在大鼠清醒狀態(tài)下移去引導(dǎo)管針芯，植入CMA/12微透析針(內(nèi)徑0.05 mm，膜長4 mm，瑞典CMA公司)，項圈固定在大鼠自由活動裝置儀上，微透析針輸入端與CMA/102微量注射泵相連，輸出端接CMA170冷收集器，微量泵內(nèi)充滿人工腦脊液，以2μl/min速率持續(xù)灌注，灌注2 h平衡后開始收集微透析液，每管收集15 min，分別在注射前、注射后30min、第 1天、第 4天、第 7天、第14天連續(xù)采集3管，存入-80℃冰箱擇期檢測。

1.5 高效液相-熒光檢測器(美國 Waters公司)柱前衍生法檢測透析液中Glu、GABA的濃度

13.5 mg OPA 、500μl MeOH 、5μl β-巰基乙醇加入4.5 ml硼酸鹽緩沖液混勻，檢測前予硼酸鹽緩沖液稀釋 2 倍，取 20μl與 35μl硼酸鹽緩沖液及 5μl透析樣品混勻，靜置約1 min待衍生反應(yīng)完全后，吸20μl注入進樣器。色譜條件:檢測系統(tǒng)為Multiλ Fluorescence Detector(Waters 2475)，反相色譜柱 Nova-pak C18(150mm ×3.9mm ，粒徑5μm)，利用單泵恒流洗脫，設(shè)定柱溫30℃，流速1.0ml/min，熒光檢測器設(shè)定激發(fā)波長為Ex330nm，發(fā)射波長為Em420nm，流動相為:0.1 mol/L磷酸氫二鈉，1 mmol/L EDTA和25%MeOH，調(diào)pH值至6.4。檢測后采用Empower分析軟件對峰下面積積分，再以標準品濃度-峰下面積做校正曲線，計算樣品的濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)和腦電變化

2.1.1 大鼠行為學(xué)改變 空白組(KB)大鼠行為學(xué)未見癲癇發(fā)作;致癇組呈現(xiàn)急性期、靜止期、慢性期改變。從圖1A看出:與海人酸組(KA)比較電刺激組(DBS)明顯減少慢性期反復(fù)自發(fā)性發(fā)作的次數(shù)(P＜0.05);而假刺激組(Pseudo-DBS)則無明顯改變。

2.1.2 大鼠腦電圖改變 如圖1C中的圖(a)所示，海人酸注射前以α波為主，海人酸注射后急性期以陣發(fā)性棘波、尖波為主如圖(b)，靜止期以α波為主以及散在慢波如圖(c)，慢性期出現(xiàn)陣發(fā)性的棘慢復(fù)合波如圖(d)。電刺激能明顯減少癇性放電頻率(P＜0.05);而假刺激組則無明顯改變(P＞0.05，圖1B)。

2.2 不同時間大鼠海馬細胞外Glu的濃度變化

如圖2所示，注射海人酸前4組的基礎(chǔ)值無明顯差異，注射海人酸后與空白組(KB)比較海人酸組、假刺激組、電刺激組的Glu均明顯升高，以第1天最為顯著(250%左右)，并持續(xù)至第14天(150%左右)，與海人酸組比較電刺激組Glu明顯下降(P＜0.01)，而假刺激組則無明顯改變;與假刺激組比較電刺激組Glu也明顯下降(P＜0.01)。

Fig.1 Change of EEG and Behaviour

2.3 不同時間大鼠海馬細胞外GABA的濃度變化

如圖3所示，注射海人酸前4組的基礎(chǔ)值無明顯差異，注射海人酸后與空白組比較海人酸組、假刺激組、電刺激組的GABA于第1天明顯升高(200%左右，P＜0.01)，后逐漸下降于第4天保持120%水平;電刺激組與海人酸組、假刺激組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 不同時間點海馬細胞外Glu/GABA的比值變化

如圖4所示，注射海人酸后比值升高，第4天最高，近2倍;電刺激組的比值較海人酸組和假刺激組有所下降(P＜0.05)，至第14天接近正常水平。

Fig.2 Content of EC glutamate(Glu)in the hippocampus of rats

Fig.3 Content of EC of GABA in the hippocampus of rats

Fig.4 Change of Glu/GABA ratio

3 討論

本研究在觀察高頻電刺激海馬治療海人酸致癲癇大鼠效果的同時動態(tài)監(jiān)測海馬細胞外神經(jīng)遞質(zhì)的變化，以探討高頻電刺激治療癲癇可能的機制。研究結(jié)果顯示高頻電刺激海馬能明顯減少海人酸致癇大鼠的自發(fā)性發(fā)作，同樣能減少腦電圖癇性放電，說明了電刺激海馬癲癇灶，可能作為一個有效的控制癲癇發(fā)作的方法。

關(guān)于癲癇的發(fā)病機制目前尚不明確，其機制之一是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡。Glu是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，致癇后其水平常升高，參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。GABA是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，致癇后其改變結(jié)果不一，但兩者的失衡可能是癲癇發(fā)作的機制之一。本結(jié)果顯示海人酸注射后海馬細胞外Glu濃度明顯升高，支持了Glu參與了癲癇的啟動的論點[3]，至慢性期有所下降仍保持較高的水平，這是癲癇活動的結(jié)果同時也是維持癲癇所必需的[3]。而海人酸致癇后海馬細胞外GABA的濃度也有所升高，至慢性期保持高于正常水平，這和以往的實驗似乎不同[5-6]，可能是機體自我保護的結(jié)果。海馬神經(jīng)元幾乎沒有GABA囊泡，海人酸刺激后并沒有立即引起GABA的大量釋放，而是由于Glu大量增加后引起一系列細胞毒性的同時，膠質(zhì)細胞立即通過轉(zhuǎn)運體對Glu進行重攝取，其代謝產(chǎn)物也能合成GABA，然后轉(zhuǎn)給中間神經(jīng)元，起到對神經(jīng)元的保護作用。還有，致癇后Glu/GABA的比值升高，至慢性期出現(xiàn)自發(fā)性發(fā)作時其比值仍高于空白組，這也說明了主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡是癲癇形成的機制之一。

本研究結(jié)果顯示電刺激能降低海馬細胞外Glu的水平，使Glu/GABA的比值下降，至第14天趨于正常，而Glu的降低并不伴隨著GABA的變化，說明高頻電刺激海馬控制癲癇并不能簡單解釋為像電刺激STN產(chǎn)生類似毀損的效果。通常認為，丘腦是大腦皮質(zhì)興奮的起搏器，Papez環(huán)路(邊緣系統(tǒng))則將海馬連接至丘腦、扣帶回、內(nèi)嗅區(qū)、海馬回。高頻電刺激使海馬至丘腦的Glu能神經(jīng)元輸出減少，阻斷了Papez環(huán)路及海馬-皮質(zhì)回路，抑制了海馬的過度興奮及海馬向皮質(zhì)傳遞異常放電。關(guān)于腦深部電刺激治療癲癇可能作用機制，人們提出了四種假設(shè)[7]:(1)去極化阻滯;(2)突觸抑制;(3)突觸阻抑:高頻刺激使得神經(jīng)遞質(zhì)耗竭，阻礙突觸信息傳遞從而影響了電極周圍的神經(jīng)信號的輸出;(4)刺激改變了病理性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能。本研究結(jié)果顯示一方面，高頻電刺激海馬能選擇性地耗竭海馬突觸周圍的Glu，使其與海人酸受體結(jié)合減少，引起細胞膜對鈉、鈣離子的通透性降低，減少了鈉、鈣離子進入神經(jīng)元內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化受阻滯，抑制了異常放電的傳播;另一方面，電刺激時，電極植入復(fù)雜的容積導(dǎo)體中，其周圍有神經(jīng)元胞體、軸突、樹突，電刺激可同時影響局部神經(jīng)元、其傳入、傳出投射纖維以及與其周圍相互連續(xù)的神經(jīng)纖維[8]，因此直接或間接地抑制了異常電活動的擴布;還有，海馬區(qū)興奮性氨基酸Glu量的減少抑制了病理性的長時程突觸增強(LTP)，同時高頻電刺激(130Hz)能激活了有效的LTP，從而改變病理性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能[9].因此電刺激治療癲癇并不能簡單解釋為神經(jīng)元的抑制，是多方面同時作用的結(jié)果。

關(guān)于電刺激對海馬細胞外GABA的影響，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)電刺激沒有改變海馬細胞外GABA的濃度。這可能與海馬神經(jīng)元本身幾乎沒有GABA囊泡有關(guān)。但有研究表明海馬CA1區(qū)GABA神經(jīng)元與Glu存在著復(fù)雜的突觸聯(lián)系[10]，本實驗研究表明電刺激后Glu/GABA的比值下降，時間越長越趨于正常，說明了電刺激可能通過調(diào)節(jié)Glu/GABA的比值達到抗癲癇的效果。

總之，本研究結(jié)果表明高頻電刺激海馬能減少癲癇的自發(fā)性發(fā)作，選擇性地耗竭海馬細胞外Glu的水平，在高頻電刺激海馬控制癲癇中起到重要的作用。其機制不能簡單解釋為神經(jīng)元的抑制，是多方面同時作用的結(jié)果。此外電刺激并不影響GABA的釋放。

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