江 剛，戴愛(ài)國(guó)

(1.湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410005;2.湖南省老年醫(yī)院-湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所呼吸疾病研究室，長(zhǎng)沙 410016)

氧化/抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要發(fā)病機(jī)制之一，香煙煙霧是引起COPD進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。核因子相關(guān)因子 2(nuclear factor-E2 related factor，Nrf2)是調(diào)節(jié)抗氧化基因和維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是肺內(nèi)主要的抗氧化劑，GSH及其合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)在COPD的抗氧化機(jī)制中具有重要作用。研究表明不典型蛋白激酶C(antypical protein kinase C，aPKC)、磷酯酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositol-3-kinase，PI3K)信號(hào)通路參與Nrf2激活及對(duì)抗氧化基因的調(diào)節(jié)[1]。本研究通過(guò)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)大鼠氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，使用PI3K 和aPKCι/ζ抑制劑進(jìn)行干預(yù)，探討PI3K/Akt-aPKCι/ζ-Nrf2 信號(hào)通路在大鼠氣道上皮細(xì)胞抗氧化機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 白沙牌香煙(湖南白沙卷煙廠)、RTPCR(日本Toyobo公司)、RO318220和Nrf2多克隆抗體(美國(guó) Santa Cruz公司)、LY294002 和 p-aPKCι/ζ抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)、PIERCE蛋白提取液(美國(guó)Pierce公司)、異硫氰酸(FITC)-藕聯(lián)的抗大鼠抗體和抗兔抗體(北京中杉金橋)、γ-GCS多克隆抗體和細(xì)胞角蛋白18單克隆抗體(武漢博士德生物公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量180～200g，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源及分組

1.2.1 大鼠氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 參照Wu等方法培養(yǎng)SD大鼠氣道上皮細(xì)胞，待細(xì)胞 70%～80%融合時(shí)，采用電鏡和細(xì)胞角蛋白18免疫熒光方法鑒定及分別取1×106個(gè)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次[2]。

1.2.2 分組 將30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和CSE(cigarette smoke extract，CSE)處理組，每組 5 只 。CSE處理組為將氣道上皮細(xì)胞與含10%CSE和20%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)1、3、6和12 h，aPKCι/ζ抑 制 劑 RO318220組 和 PI3K 抑 制 劑LY294002組則在加入CSE前0.5 h加入3μmol/L RO318220抑制劑和或 10μmol/L LY294002 ，其余處理同CSE 3 h組。

1.3 香煙煙霧提取物的制備

參照Nakamura等方法將制備的CSE在30min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)[3]。

1.4 流式細(xì)胞分析

消化并收集細(xì)胞，制成濃度為1×106的單細(xì)胞懸液，加入熒光素標(biāo)記的FITC-p-Akt抗體，避光，冰上孵育和固定，加入同型對(duì)照組消除非特異性熒光，流式細(xì)胞儀(FACSort，Becton-Dickinson)檢測(cè)表達(dá)p-Akt細(xì)胞率，數(shù)據(jù)分析采用Cellquest軟件(Becton-Dickinson)。

1.5 細(xì)胞免疫化學(xué)染色

采用鏈親和素蛋白過(guò)氧化物酶法按以下步驟進(jìn)行:將爬有氣道上皮細(xì)胞的蓋玻片常規(guī)固定、滴加兔抗γ-GCS多克隆抗體和抗兔二抗抗體、顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片及觀察，陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替一抗進(jìn)行孵育。結(jié)果觀察:各隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)算機(jī)自動(dòng)測(cè)量并計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)積分吸光度(A)值(病理圖文分析系統(tǒng)PAS9000，無(wú)錫朗珈生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)，取平均值作為各實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞免疫熒光染色

一抗為兔抗大鼠 NRF2多克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的抗兔抗體，操作步驟按細(xì)胞免疫化學(xué)，熒光顯微鏡下觀察熒光的表達(dá)部位。

1.7 Western blot檢測(cè)

按PIERCE提取液操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞胞漿蛋白和核蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，然后各泳道以200μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉后依次加入一抗和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗大鼠二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，X線膠片顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon Gis-2010China)對(duì)所得條帶吸光度半定量，β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算待測(cè)條帶的吸光度與內(nèi)參照吸光度比值。

1.8 RT-PCR檢測(cè)

采用Trizol、氯仿/異丙醇法提取細(xì)胞中總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大鼠γ-GCS上、下游引物分別5'-CGTGGTGGATGGGTGTAGC-3'和5'-TAAAGCCTGATCCAAG TAACTCTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為359 bp。以G3PDH為內(nèi)參照，其上、下游引物分別為:5'-TCACCATCTTCCAG GAGCGAG-3'和5'-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為450bp。PCR反應(yīng)條件為94℃變性1 h，63℃退火1 min，72℃延伸 30s，32 循環(huán) 。取 8μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙烷1 mg/L)電泳觀察，用Bio-Rad Gel Doc 2000型凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，所測(cè)擴(kuò)增條帶積分光吸度值用內(nèi)參照修正。

1.9 γ-GCS活性測(cè)定

γ-GCS活性測(cè)量采用雙酶法[2]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CSE對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

細(xì)胞免疫熒光顯示Nrf2蛋白在對(duì)照組、CSE 12 h組主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿，而在CSE 1、3和6 h組主要在胞核中表達(dá);Western blot分析表明在對(duì)照組和CSE 12 h組Nrf2胞漿蛋白表達(dá)增強(qiáng)，胞核蛋白弱表達(dá)，而在CSE 1、3和6 h組Nrf2胞核蛋白表達(dá)增強(qiáng)，胞漿蛋白表達(dá)減弱。細(xì)胞免疫熒光和Western blot分析顯示在抑制劑組Nrf2蛋白主要表達(dá)在胞漿，其胞漿蛋白表達(dá)增強(qiáng)，胞核蛋白弱表達(dá)，三組與CSE 3 h組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1，表1)。

Fig.1 Effect of CSE on Nrf2 protein in the bronchial epithelial cells of rats by immunofluorescence staining(×400)

2.2 CSE對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞p-Akt蛋白質(zhì)的影響

Western blot結(jié)果顯示在CSE 1和3 h組，p-Akt蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，在 LY294002組和 RO318220+LY294002組，其表達(dá)減弱，與CSE 3 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在 RO318220組，其表達(dá)增強(qiáng)，與CSE 3 h組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05，圖2)。

2.3 CSE對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞p-aPKCι/ζ蛋白質(zhì)的影響

Western blot結(jié)果顯示，p-aPKCι/ζ蛋白質(zhì)在暴露CSE后1 h增強(qiáng)，3 h最強(qiáng)，6 h減弱，三組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，而在抑制劑組其蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯減于CSE 3 h組(P＜0.05)。流式分析結(jié)果表明表達(dá)p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞率的變化趨勢(shì)與其蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)相同(圖2，表1)。

Fig.2 Western blot analysis of the expression of γ-GCS，p-Akt and p-aPKCι/ζproteins in the bronchial epithelial cells of rats

Tab.1 Effect of nucleic and cytoplasmic Nrf2 proteins，p-Akt and aPKCι/ζproteins in the bronchial epithelial cells of rats exposed to CSE(A value，，n=5)

Tab.1 Effect of nucleic and cytoplasmic Nrf2 proteins，p-Akt and aPKCι/ζproteins in the bronchial epithelial cells of rats exposed to CSE(A value，，n=5)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CSE 3 h group

Group Nrf2 Cytoplasmic Nucleic p-Akt p-aPKCι/ζ Control 1.06±0.07# 0.51±0.05# 0.38±0.06# 0.41±0.07#CSE 1h 0.51±0.06* 1.03±0.05* 0.70±0.09*# 0.97±0.18*#CSE 3h 0.51±0.05* 1.06±0.08* 1.47±0.13* 1.65±0.14*CSE 6h 0.52±0.04* 1.01±0.03* 0.76±0.11*# 0.52±0.09*#CSE 12h 1.02±0.08# 0.55±0.06# 0.39±0.06# 0.42±0.07#LY294002 1.03±0.07# 0.56±0.08# 0.40±0.07# 0.42±0.08*RO-31-8220 0.98±0.11* 0.54±0.05# 1.44±0.16# 0.45±0.11#LY294002+RO-31-8220 0.96±0.09* 0.51±0.08# 0.39±0.06# 0.41±0.07#

2.4 CSE對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞GSH影響

暴露CSE 1 h，GSH含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，暴露CSE 3、6 h，GSH 含量明顯增高并高于對(duì)照組(P ＜0.05)，而預(yù)先使用 aPKCι/ζ抑制劑RO318220或和PI3K抑制劑LY292002，GSH含量下降，明顯低于CSE 3 h組(P＜0.05)，三組抑制劑組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05，表2)。

2.5 CSE對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞γ-GCS mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR分析顯示暴露CSE 1、3和6 h，γ-GCSm-RNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，組間比較有顯著差異(P＜0.05);在抑制劑組γ-GCSmRNA弱表達(dá)，較CSE 3 h組顯著降低(P＜0.05)，組間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05，表2)。

2.6 CSE對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞γ-GCS蛋白質(zhì)的影響

細(xì)胞免疫化學(xué)顯示在CSE 1、3和 6 h組，γ-GCS蛋白質(zhì)在胞漿為中度至強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在抑制劑組其弱陽(yáng)性表達(dá)。Western blot分析顯示暴露CSE 1、3和6 h，γ-GCS蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，6 h達(dá)高峰，三組均明顯高于對(duì)照組，組間比較差異顯著(P＜0.05)，而在抑制劑組其表達(dá)明顯減弱，三組均明顯低于CSE 3 h組(P＜0.05，圖3，表2)。

Tab.2 Effect of CSE onGSH content(nmol/mg pro)，γ-GCS protein，mR NA and activity(U)in the bronchial epithelial cells of rats exposed to CSE(A value，，n=5)

Tab.2 Effect of CSE onGSH content(nmol/mg pro)，γ-GCS protein，mR NA and activity(U)in the bronchial epithelial cells of rats exposed to CSE(A value，，n=5)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CSE 3 h group

Group γ-GCS IHC Western blot RT-PCR GSH content γ-GCS activity Control 0.09±0.03# 0.39±0.05# 0.47±0.10# 45.33±4.2# 0.66±0.06#CSE 1h 0.16±0.03# 1.19±0.12*# 1.20±0.22*# 15.94±2.53*# 1.82±0.11*#CSE 3h 0.21±0.02* 1.65±0.18* 1.82±0.18* 73.76±4.92* 2.23±0.32*CSE 6h 0.38±0.05# 2.65±0.35*# 2.13±0.20*# 86.87±5.56*# 3.31±0.29*#CSE 12h 0.10±0.03# 0.45±0.05# 0.51±0.06# 50.72±5.70# 0.65±0.08#LY294002 0.12±0.02*# 0.41±0.08*# 0.49±0.08*# 46.58±5.33# 0.71±0.10*#RO318220 0.12±0.03*# 0.39±0.05*# 0.48±0.08*# 48.57±2.68# 0.67±0.06*#LY294002+RO318220 0.10±0.03*# 0.39±0.06*# 0.50±0.07*# 45.79±4.78# 0.69±0.11*#

Fig.3 Effect of CSE on γ-GCS protein in the bronchial epithelial cells of rats by immunocytochemistry staining(×200)

2.7 CSE對(duì)γ-GCS活性的影響

暴露CSE 1、3和6 h，γ-GCS活性逐漸增高，較對(duì)照組顯著增高，且組間比較有顯著差異，而在抑制劑組明顯低于CSE 3 h組(P＜0.05，表2)。

2.8 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示Nrf2與 γ-GCS、p-Akt和p-aPKCι/ζ呈正相關(guān)，p-aPKCι/ζ與 γ-GCS、p-Akt及 Nrf2 成正相關(guān) ，p-Akt與 γ-GCS 、p-aPKCι/ζ及 Nrf2 成正相關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

GSH是肺內(nèi)主要的抗氧化劑。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠氣道上皮細(xì)胞暴露CSE后，GSH含量首先出現(xiàn)消耗，然后逐漸升高，6 h達(dá)高峰。表明CSE通過(guò)氧化應(yīng)激造成GSH耗竭，引起氧化/抗氧化失衡，繼而增加GSH合成對(duì)抗氧化應(yīng)激。

γ-GCS是肺內(nèi)主要的抗氧化基因，是合成GSH的限速酶。我室前期研究已證明在COPD大鼠和患者中γ-GCS活性、mRNA、蛋白質(zhì)明顯高于正常對(duì)照組[4]。本研究結(jié)果表明，暴露CSE 后1、3、6 h，γ-GCSmRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在暴露CSE 1 h，其表達(dá)增加約1.85倍，3h約增加2.6倍，6 h約增加3.87倍，呈時(shí)間依賴性;γ-GCS蛋白質(zhì)和活性變化趨勢(shì)與其mRNA變化趨勢(shì)相同;GSH含量在暴露CSE 3 h增加，6 h達(dá)高峰。以上分析表明CSE通過(guò)氧化應(yīng)激上調(diào)γ-GCS mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，提高γ-GCS的活性，增加GSH合成。

目前研究認(rèn)為Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)，是氧化還原感受器[5]。γ-GCS是肺內(nèi)主要的抗氧化基因，是Nrf2調(diào)節(jié)的靶基因[6]。大鼠γ-GCS啟動(dòng)子缺乏ARE序列，Nrf2調(diào)節(jié)其機(jī)制仍不清楚。Li等研究表明Nrf2通過(guò)與γ-GCS上游某ARE相似區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)γ-GCS表達(dá)[7]。本研究結(jié)果顯示，暴露CSE 1、3、6 h，Nrf2蛋白質(zhì)主要表達(dá)在胞核，其胞核蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明CSE誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，同時(shí)，γ-GCSmRNA、蛋白質(zhì)及其活性逐漸增強(qiáng)。相關(guān)性分析顯示Nrf2與γ-GCS呈正相關(guān)。Reddy等研究表明Nrf2(-/-)大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞γ-GCS表達(dá)和GSH含量明顯低于Nrf2(+/+)大鼠[8]。以上分析表明CSE通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)移，與γ-GCS的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)γ-GCS表達(dá)。

研究表明PKC信號(hào)通路參與激活Nrf2。本研究發(fā)現(xiàn)，p-aPKCι/ζ蛋白質(zhì)在暴露 CSE 1 h 增強(qiáng)，3 h達(dá)高峰，6 h稍降低，且Nrf2出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，其胞核蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng) ;預(yù)先加入RO318220，p-aPKCι/ζ蛋白表達(dá)減弱，Nrf2主要表達(dá)在胞漿，未出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，其胞漿蛋白水平增強(qiáng)，表明 CSE通過(guò)aPKCι/ζ誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，aPKCι/ζ抑制劑影響Nrf2核轉(zhuǎn)位。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，在 RO318220組，γ-GCS蛋白和mRNA低表達(dá)，其活性和GSH含量降低，表明RO318220影響γ-GCS表達(dá)和GSH 合成。相關(guān)性分析表明 aPKCι/ζ與Nrf2、γ-GCS及GSH成正相關(guān)。以上分析表明aPKCι/ζ參與Nrf2激活及其對(duì)γ-GCS調(diào)節(jié)和GSH合成。

研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路也參與激活Nrf2及其對(duì)抗氧化基因的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，暴露CSE 1和3 h，p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增加，其蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增強(qiáng)，且Nrf2胞核蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)。然而，預(yù)先加入PI3K抑制劑LY294002，p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞率及其蛋白質(zhì)表達(dá)減弱，Nrf2胞核蛋白質(zhì)表達(dá)減弱，γ-GCS蛋白質(zhì)、mRNA及其活性降低，GSH合成減少。相關(guān)性分析表明p-Akt與γ-GCS、Nrf2成正相關(guān)。Arisawa等研究證明熊去氧膽酸通過(guò)活化PI3K/Akt促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，提高γ-GCS表達(dá)和GSH合成，而LY294002抑制Nrf2核轉(zhuǎn)位和降低GSH水平[9]。以上分析表明CSE通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，LY294002抑制Nrf2核轉(zhuǎn)位及降低抗氧化基因γ-GCS表達(dá)和GSH合成。

本研究結(jié)果表明，預(yù)先予以 RO318220，p-aPKCι/ζ蛋白質(zhì)表達(dá)降低 ，p-Akt蛋白質(zhì)無(wú)明顯改變 ，而預(yù)先加入 LY294002，p-aPKCι/ζ和 p-Akt蛋白質(zhì)均弱表達(dá);相關(guān)性分析表明 p-Akt與 aPKCι/ζ成正相關(guān)。表明 PI3k/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)aPKCι/ζ表達(dá)。

總之 ，本研究表明 PI3k/Akt-aPKCι/ζ信號(hào)通路可能參與Nrf2對(duì)抗氧化基因γ-GCS的調(diào)控。其可能機(jī)制是，CSE通過(guò)氧化應(yīng)激耗竭抗氧化劑GSH，造成氧化/抗氧化失衡，同時(shí)，通過(guò)PI3k/Akt-aPKCι/ζ信號(hào)通路激活Nrf2，引起Nrf2核轉(zhuǎn)位，與γ-GCS的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)γ-GCS mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，提高γ-GCS的活性，增加GSH合成，對(duì)抗氧化應(yīng)激，維持氧化/抗氧化平衡。 對(duì) PI3k/Akt-aPKCι/ζ-Nrf2-γ-GCS 信號(hào)通路的進(jìn)一步研究有助于更加深入了解COPD氧化/抗氧化發(fā)病機(jī)制，為尋找更有效的治療方法提供理論研究基礎(chǔ)。

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