薛 猛，崔 潔，夏 雯，李 英，錢令波，葉治國，王會平，夏 強

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，杭州 310058)

S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)是大蒜中一種主要的水溶性硫化物，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定[1]，口服后可以迅速被吸收，在大鼠中的生物利用度高達98.2%，然后主要分布在血液、肝臟和腎臟中，最后以N-乙?；男问綇哪I臟隨尿液排出。近年來，心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康和生存的主要原因之一，并且心血管疾病的發(fā)病率呈上升的趨勢。缺血/再灌(ischemia/reperfusion，I/R)損傷導(dǎo)致組織損傷、功能異常甚至細胞死亡。盡管引起I/R損傷的原因有很多并且比較復(fù)雜，但是普遍認為I/R大量釋放活性氧及細胞內(nèi)的鈣離子超載是引起損傷的主要原因。SAC在腦及腎臟I/R損傷中通過抗氧化起到保護作用已經(jīng)得到證實[2]。同時研究表明大蒜素后處理能減輕家兔在體心肌I/R損傷，但具體的作用機制并不清楚。本實驗旨在探討SAC對離體大鼠心肌I/R損傷的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性SD大鼠，體重240～280g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。S-烯丙基-L-半胱氨酸及蘇氨酸購于上海瀚鴻化工科技有限公司，考馬斯亮蘭試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所，活性氧試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，3-[4，5-dimethylthiazol-2-y1]-2，5-diphenyhetrazolium bromide(MTT)購自Sigma公司。

1.2 離體心臟Langendorff灌流和左室功能評價

分離SD大鼠心臟，固定于Langendorff灌流裝置，以K-H液行常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流。K-H液成分如下(mmol/L):NaCl 118.0，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4?7H2O 1.2，NaHCO32.5，葡萄糖 10.0，CaCl21.4，以 95%O2+5%CO2飽和，維持灌流液溫度37℃。切開左心耳，將充水乳膠囊由此插入左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)壓力傳感器，持續(xù)記錄和分析左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、心率(heart rate，HR)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dP/dtmax)等血流動力學(xué)指標(biāo)。

1.3 LDH活性的測定

在再灌注各時間點收集冠脈流出液，利用分光光度法測定灌流心臟流出液乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性。

1.4 心肌細胞活性的測定

心臟從灌流裝置取下后切成薄片(1～2 mm)，37℃用1.25 g/L的MTT孵育30min，取出心肌片吸干表面水分并稱濕重，按40ml/g的量加入二甲基亞砜后勻漿，離心(1000×g，10min)，取上清液1 ml在490nm處測定其吸光度。

1.5 SOD活性的測定

冰凍的心臟在勻漿液(10mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose，0.8%NaCl，pH 7.4)中制成10%的組織勻漿液。考馬斯亮蘭法定蛋白。按照超氧化物歧化酶(superoxide dimutase，SOD)試劑盒采用黃嘌呤氧化酶法測定組織勻漿中的SOD水平。

1.6 活性氧(ROS)含量的測定

將組織勻漿液用0～4℃0.86%NaCl溶液稀釋至蛋白濃度為 200μg/ml，黑暗處加載 DCFH-DA探針，37℃孵育30min。485 nm激發(fā)光，530nm接受光下測得DCF的熒光強度。DCF的熒光水平反應(yīng)了組織中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量。

1.7 實驗分組

大鼠隨機分為7組:(1)對照組:K-H液平衡30min，全心停灌30min，復(fù)灌120min;(2-5)SAC組:停灌前 15 min分別用含SAC(5×10-6mol/L，5×10-5mol/L，5×10-4mol/L和 5×10-3mol/L)的K-H 液灌流;(6)Thr組:停灌前 15 min用含Thr(1×10-2mol/L)的K-H液灌流。(7)SAC+Thr組:停灌前 15 min用含SAC(5×10-5mol/L)和Thr(1×10-2mol/L)的KH液灌流。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 SAC預(yù)處理對血流動力學(xué)指標(biāo)的影響

SAC預(yù)處理組LVDP、RPP、±dP/dtmax的恢復(fù)明顯高于對照組。Thr組跟對照組之間沒有顯著性差異。SAC+Thr組降低了SAC預(yù)處理對血流動力學(xué)的改善(表1～表4)。

Tab.1 Effect of pretreatment with SAC on LVDP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.1 Effect of pretreatment with SAC on LVDP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

SAC:S-allyl-L-cysteine;Thr:Threonine*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(79.88±8.39) 78.42±9.06 74.29±5.82 57.28±6.43 51.01±5.84 SAC(5×10-6mol/L) 100(80.97±10.69) 85.54±5.55 77.69±4.63 65.01±8.30 52.75±7.36 SAC(5×10-5mol/L) 100(75.52±5.86) 97.78±12.05* 92.87±8.60** 79.92±13.58** 75.98±9.45**SAC(5×10-4mol/L) 100(85.40±17.23) 95.76±9.68* 88.74±9.88* 80.52±10.50** 72.48±15.81**SAC(5×10-3mol/L) 100(63.84±13.13) 90.39±7.84 86.44±6.88 76.59±13.10* 71.43±7.80**Thr 100(82.10±22.05) 82.36±11.45 72.35±11.51 59.21±11.78 45.20±11.14 SAC+Thr 100(89.73±9.45) 83.58±7.03 77.41±9.26# 54.75±8.08## 47.47±9.84##

Tab.2 Effect of pretreatment with SAC on RPP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.2 Effect of pretreatment with SAC on RPP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(20667.62±2261.12)73.64±8.99 68.38±8.14 55.69±8.53 47.34±8.94 SAC(5×10-6mol/L) 100(24054.37±2374.29)82.09±5.31 71.76±4.04 59.01±7.24 46.04±5.28 SAC(5×10-5mol/L) 100(17709.97±3149.09)98.30±15.47** 80.55±9.00** 73.68±11.34* 67.82±10.82*SAC(5×10-4mol/L) 100(19566.24±4884.62)98.86±9.78** 87.74±11.74** 71.98±10.77* 65.16±16.11*SAC(5×10-3mol/L) 100(17177.25±4292.22)94.70±7.58** 82.96±3.73** 71.74±12.77* 66.00±9.81*Thr 100(22394.15±6475.45)87.14±6.28 78.54±5.04 66.30±10.92 59.82±10.11 SAC+Thr 100(24773.31±4862.99)79.47±7.84# 67.35±4.27## 46.13±5.20## 37.57±5.03##

Tab.3 Effect of pretreatment with SAC on+dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.3 Effect of pretreatment with SAC on+dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(2376.02±359.92) 81.81±10.11 76.27±5.14 64.49±9.09 58.90±4.55 SAC(5×10-6mol/L) 100(2913.68±452.09) 89.18±4.50 79.52±3.37 66.53±8.47 59.23±10.81 SAC(5×10-5mol/L) 100(2395.07±525.93) 96.59±9.29 92.05±8.33* 79.31±10.65 71.60±11.20SAC(5×10-4mol/L) 100(2542.44±757.83) 97.41±8.47 90.19±10.31* 83.33±13.51* 75.96±15.23*SAC(5×10-3mol/L) 100(2250.03±289.44) 90.70±7.49 89.03±8.48* 80.14±8.98 79.01±9.98*Thr 100(3053.97±540.65) 87.14±6.28 78.54±5.04 66.30±10.92 59.82±10.11 SAC+Thr 100(3360.36±762.11) 86.57±11.63 75.98±8.52# 64.40±8.38 53.69±8.35#

Tab.4 Effect of pretreatment with SAC on-dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.4 Effect of pretreatment with SAC on-dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(-1415.45±263.95) 82.44±6.47 70.88±11.35 64.30±7.43 45.29±4.85 SAC(5×10-6mol/L) 100(-2053.86±359.49) 85.11±8.49 75.54±8.51 64.15±5.54 48.76±2.82 SAC(5×10-5mol/L) 100(-1471.58±193.59) 97.40±6.30* 91.08±5.96* 76.51±14.54 69.80±12.19**SAC(5×10-4mol/L) 100(-1453.04±366.05) 97.39±8.96* 89.39±8.75* 78.18±8.78 70.18±9.57**SAC(5×10-3mol/L) 100(-1320.42±283.35) 89.80±8.84 85.35±10.00 78.66±10.48 71.97±11.49**Thr 100(-1869.46±427.36) 87.14±6.28 78.54±5.04 66.30±10.92 59.82±10.11 SAC+Thr 100(-2001.01±215.94) 87.41±4.45 79.95±6.84 61.63±3.67# 57.03±4.31#

2.2 SAC預(yù)處理對心臟灌流液中LDH的影響

跟對照組相比，SAC預(yù)處理明顯降低復(fù)灌期間冠脈流出液中LDH含量;Thr預(yù)處理對LDH的影響與對照組沒有顯著性差異。SAC+Thr預(yù)處理可顯著減弱SAC對LDH的降低作用(圖1)。

Fig.1 Effect of SAC on LDH level in the coronary efflucent during reperfusion of isolated rat heart following ischemia(n=6)

2.3 SAC預(yù)處理對心肌細胞活度的影響

SAC預(yù)處理跟對照組比較顯著提高心肌細胞的活度;Thr預(yù)處理跟對照組相比沒有顯著性差異。SAC+Thr預(yù)處理明顯降低心肌細胞的活度(圖2)。

2.4 SAC預(yù)處理對心肌組織中SOD活性及ROS釋放的影響

和對照組相比，5×10-5mol/L的SAC預(yù)處理顯著性提高心肌組織勻漿中SOD的水平(圖3 A)。同時明顯降低心肌組織勻漿中ROS釋放的水平(圖3 B見下頁)。

3 討論

大蒜素于19世紀被發(fā)現(xiàn)具有抗菌的活性，于是其被廣泛地用于抗細菌、病毒和真菌的感染。隨著國內(nèi)外對于大蒜素的關(guān)注，對于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，藥理作用及臨床應(yīng)用的研究也不斷的深入。SAC是大蒜素的主要組成成分，也是主要的有效作用成分。除抗菌，抗病毒以外，SAC還可以對抗腫瘤的發(fā)生，參與免疫反應(yīng)。同時還能降低膽固醇和血壓，抗血小板聚集。對許多肝臟疾病及心血管疾病有很好的預(yù)防作用。綜其作用與它的抗氧化作用有很大關(guān)系。在家兔在體心肌I/R模型中給予大蒜素的干預(yù)研究表明，大蒜素的后處理能夠明顯改善家兔的心功能，減輕心肌病理變化。但對于具體的作用機制尚未見報道。本實驗在離體大鼠心肌I/R模型上發(fā)現(xiàn)，SAC預(yù)處理明顯改善I/R后左心室功能的變化，可減少I/R后心肌細胞的死亡，減少心肌損傷標(biāo)志酶LDH的同時也降低了心肌細胞的死亡，表明SAC對心肌有一定的保護作用。LDH釋放是心肌損傷的重要指標(biāo)，SAC能夠明顯降低冠脈流出液中LDH的含量，改善灌注后左心室收縮功能，這些說明SAC預(yù)處理對缺血/復(fù)灌造成的心肌損傷有保護作用，本實驗進一步的實驗表明SAC能夠抑制心肌中ROS的生成，同時提高了清除自由基的關(guān)鍵酶SOD的活性。

SAC是一種水溶性的氨基酸，不能直接透過細胞膜[1]，明確SAC如何進入細胞發(fā)揮作用至關(guān)重要。目前，在心肌細胞膜上發(fā)現(xiàn)有一種氨基酸轉(zhuǎn)運體(alanine-serine-cysteine-transporter1，ASCT-1)，是一含有523個氨基酸的小分子蛋白[3]，可以允許丙氨酸 (alanine，Ala)、蘇氨酸(threonine，Thr)半胱氨酸(cysteine，Cys)等通過。ASCT-1的總量是一定的，當(dāng)細胞外液中同時有可以通過ASCT-1的Ala、Thr、Ser、Cys中的兩種以上的分子，且超過ASCT-1的最大運載能力時，各物質(zhì)便會相互競爭ASCT-1，互為通過心肌細胞膜的拮抗劑[4]。

在本實驗研究發(fā)現(xiàn)，10-2mol/L的Thr預(yù)處理對心肌再灌過程中左心室收縮功能、LDH水平和再灌結(jié)束后心肌組織formazan量無顯著影響，但10-2mol/L的Thr和5×10-5mol/L的SAC同時再灌可以減弱10-5mol/L的SAC對心肌I/R損傷的保護作用，提示Thr可以競爭性的抑制SAC進入細胞內(nèi)的量，說明SAC與Thr可能是通過同樣的轉(zhuǎn)運體，即心肌細胞膜上的ASCT-1進入心肌細胞內(nèi)。

正常心肌在有氧的情況下，能量主要來自于脂肪氧化，約占60～70%。其次是葡萄糖氧化供能及糖酵解途徑產(chǎn)生的能量。當(dāng)心肌缺血時，有氧氧化的三羧酸循環(huán)途徑受到抑制，無氧糖酵解途徑和脂肪酸氧化增加。脂肪酸氧化增加加劇了心肌缺氧，損傷增大。同時氧自由基產(chǎn)生增多，也可以引起脂質(zhì)的過氧化[5]。在心肌I/R損傷的過程中，由于內(nèi)皮細胞黃嘌呤氧化酶活性增強，心肌細胞線粒體呼吸鏈中電子的重新活化，再灌后期NADPH氧化酶的活性的增強，使得心肌細胞生活的微環(huán)境中產(chǎn)生過量的氧自由基。這些氧自由基會損傷生物膜、引起DNA斷裂，通過促進肌漿網(wǎng)中Ca2+的釋放而直接或間接誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放，在炎癥后期還可以激活炎性細胞因子，所有這些變化最終會促使I/R心肌細胞的死亡，導(dǎo)致心肌的梗死[6]。

正常情況下，體內(nèi)存在一定的氧自由基，也會有維生素E、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化的物質(zhì)來中和這些氧自由基，處于相對平衡的狀態(tài)[7]，當(dāng)抗氧化的物質(zhì)減少，或氧化的物質(zhì)增多時，氧化與抗氧化之間的平衡被打破，便會造成氧化損傷[8]。

已有的研究表明，SAC可以清除氧自由基。SAC可以通過抗氧化作用減輕腦缺血/再灌注引起的線粒體功能損傷[9]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，SAC可以減少心肌組織勻漿中ROS的水平，提高心肌組織勻漿中SOD的活性。SAC預(yù)處理對抗缺血/復(fù)灌心肌損傷的保護作用可能與其可以清除氧自由基有關(guān)。氧自由基的水平與mPTP的開放程度，及相關(guān)的細胞傳導(dǎo)通路等有關(guān)[10]，SAC預(yù)處理能否抑制mPTP通道的開放和調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞傳導(dǎo)通路還有待進一步的研究。

綜上所述，SAC具有抗心肌缺血/再灌損傷的保護作用，其機制可能與SAC通過心肌細胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運體ASCT-1進入心肌細胞內(nèi)，清除心肌細胞內(nèi)的氧自由基，提高清除自由基的SOD活性有關(guān)。

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