喬 卉,安書成,徐 暢

(陜西師范大學生命科學學院,西安 710062)

藍斑(locus coeruleus,LC)和中縫大核(raphe magnus nucleus,NRM)均可參與對胃腸功能的調(diào)節(jié),早期的研究表明,刺激LC、NRM均能影響胃活動。而迷走神經(jīng)背核(dorsal motor nucleus of the vagus,DMV)通過膽堿能-膽堿能興奮途徑以及膽堿能-非膽堿能非腎上腺素能抑制途徑調(diào)節(jié)胃運動[1,2],被認為是迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)胃運動的“最后公路”。

有研究表明,5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)可以興奮DMV中的神經(jīng)元,其作用由5-HT2A受體介導[3]。腦片全細胞記錄發(fā)現(xiàn),DMV中約50%的胃運動相關(guān)神經(jīng)元對去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)表現(xiàn)出興奮性反應[4]。

既然5-HT和NE影響著DMV的胃運動相關(guān)神經(jīng)元的活動,那么,作為腦內(nèi)主要的5-HT能來源的中縫核團,以及作為腦內(nèi)主要的NE能來源的藍斑核是否通過一定的內(nèi)在功能聯(lián)系,與DMV共同調(diào)控著胃運動,形成了胃運動中樞調(diào)控的腦干基本環(huán)路呢?本研究通過核團定位刺激、損毀、以及微量注射等方法,探討了腦干藍斑核、中縫大核和迷走神經(jīng)背核對胃運動的調(diào)節(jié)效應,以及三者在胃運動調(diào)節(jié)中的相互關(guān)系,進一步充實了胃活動的中樞調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

本實驗選用體質(zhì)量250～320g SD大鼠,雌雄不拘,由陜西中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供。實驗前禁食12～18 h,自由飲水。

利醅酮(Ritanserin)為 Sigma公司產(chǎn)品,4μg/μl溶于二甲基亞砜(DMSO);甲磺酸酚妥拉明(Phentoramin)為上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn),4μg/μl溶于生理鹽水。

1.2 實驗分組

實驗進行以下分組:(1)LC對胃運動的調(diào)控研究(n=10):①刺激LC;②損毀DMV+刺激LC;③DMV注射NS;④DMV注射酚妥拉明;⑤DMV注射酚妥拉明+刺激LC。(2)NRM對胃運動的調(diào)控研究(n=10):①刺激NRM;②損毀DMV+刺激NRM;③DMV注射DMSO;④DMV注射利醅酮⑤DMV注射利醅酮+刺激NRM。(3)NRM與LC之間的相互作用關(guān)系研究(n=10):①刺激NRM;②損毀LC+刺激NRM;③LC注射DMSO;④LC注射利醅酮;⑤LC注射利醅酮+刺激NRM。

1.3 胃內(nèi)壓的測定

20%氨基甲酸乙酯(0.6 ml/100g)腹腔注射麻醉動物后做氣管插管。打開腹腔,參照 Raybould(1987)的胃內(nèi)壓記錄方法,將距胃竇幽門括約肌0.7 cm處的十二指腸結(jié)扎并剪口,輕輕沖洗胃內(nèi)容物。向胃竇插入聚乙烯軟管約1 cm,并注入溫熱生理鹽水1.5 ml。軟管從腹腔引出,與壓力換能器聯(lián)接,信號經(jīng)PowerLab/8sp生理信號采集及分析系統(tǒng)進行采集,記錄胃內(nèi)壓,經(jīng)chart軟件分析,反映胃收縮幅度的變化。采集參數(shù)設置為:采樣率20/s,高通濾波DC,低通濾波1 Hz。

刺激或給藥前記錄胃內(nèi)壓10min,刺激或給藥后持續(xù)記錄40min,每10min為一個計量單位,應用記錄胃內(nèi)壓的軟件Chart 5計算胃收縮波振幅的平均值。藥物及刺激、損毀的處理效應用處理前后胃收縮幅度變化百分比 [(效應值-正常值)/正常值×100%]進行統(tǒng)計。

1.4 核團定位及刺激、微量注射

腹腔手術(shù)完成后,大鼠俯臥位,在腦立體定位儀上參照George Paxinos和Charles Watson的大鼠腦立體定位圖譜,按照分組需要對藍斑核(AP=9.8,L=1.35,H=0.85),中縫大核(AP=10.3,L=0,H=9.7)和迷走神經(jīng)背核(AP=13.6,L=0.7,H=0.75)進行定位。術(shù)后先做正常記錄,待胃運動波形穩(wěn)定后,再給予刺激或注射藥物。

刺激電極外徑0.5 mm,刺激參數(shù)為10Hz、100μA、波寬 1 ms、持續(xù)時間 45 s;損毀參數(shù)為 10Hz、1 mA、波寬1 ms、持續(xù)時間2 min。給藥時使用1μl微量進樣器勻速推注,總劑量為1μl,在1 min內(nèi)以勻速注射完畢,推注完成后留針2 min。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 LC對胃活動的調(diào)節(jié)作用

刺激LC后記錄胃運動40min,結(jié)果顯示胃收縮幅度分別下降了22.40%±11.47%(P<0.05,圖1A)和34.69%±13.65%、31.78%±5.09%、42.72%±11.01%(n=10,P<0.01,圖1A)。損毀DMV后刺激LC,胃收縮幅度與刺激前比較分別下降了15.93%±3.67%、18.19%±4.43%、23.28%±8.22%和21.87%±8.98%,呈顯著性差異(n=10,P<0.05,圖1A),而與單純刺激LC組比較,胃收縮幅度在20min內(nèi)和40min內(nèi)顯著升高(n=10,P<0.05,圖 1A)。

DMV注射腎上腺素能α受體阻斷劑酚妥拉明,胃收縮幅度分別升高了27.01%±9.17%、19.78%±8.40%(P<0.05)和 41.13%±11.90%、59.13%±11.35%(n=10,P<0.01,圖1B),與注射生理鹽水組比較也有差異。DMV注射酚妥拉明后再刺激LC,胃收縮幅度也極顯著升高了38.59%±9.77%、66.41%±12.40%、76.06%±12.60%和114.03%±29.87%(P<0.01,圖1B),與單純刺激LC組比較有極顯著差異(n=10,P<0.01,圖1B),而與單純注射酚妥拉明組比較在后30min也顯著升高(n=10,P<0.05)。

2.2 NRM對胃活動的調(diào)節(jié)作用

刺激NRM后記錄胃運動40min,結(jié)果顯示:胃收縮幅度在刺激后10min降低了23.02%±13.81%,與刺激前比較差異顯著(P<0.05,圖2A),在刺激后20、30、40min內(nèi)分別下降了 49.26%±17.32%、58.22%±12.43%和62.06%±17.22%,與刺激前比較差異極顯著(n=10,P<0.01,圖2A,圖3)。損毀DMV后刺激NRM,胃收縮幅度在10、20、30min內(nèi)與損毀DMV和刺激NRM前比較分別上升了7.98%±3.26%、11.60%±4.75%、1.75%±3.78%,40min內(nèi)下降了13.80%±6.24%,無顯著性差異,而與單純刺激NRM組比較,胃收縮幅度極顯著升高(n=10,P<0.01,圖2A)。

Fig.1 Regulation of LC andαreceptor in DMV on gastric motility

DMV注射5-HT2A受體阻斷劑利醅酮可以使胃收縮幅度比其自身基礎(chǔ)值顯著降低42.45%±10.00%、70.50% ±19.28%、72.50% ±22.32%、72.90% ±17.55%(n=10,P<0.01,圖 2B),與 DMV內(nèi)微量注射二甲基亞砜的對照組比較,也有極顯著差異。而DMV注射利醅酮后再刺激NRM,胃收縮幅度比其自身基礎(chǔ)值顯著下降了49.45%±12.03%、57.47% ±15.30%、64.84% ±15.33%和71.30%±9.44%(n=10,P<0.01,圖 2B),與單純注射利醅酮組和單純刺激NRM組比較均無顯著性差異(n=10,P>0.05,圖2B)。

Fig.2 Regulation of NRM and 2A receptor in DMV on gastric motility

Fig.3 Gastric motility wave recorded 10min before and 20min after NRM stimulation

這樣的結(jié)果提示我們,NRM通過DMV發(fā)揮了抑胃作用,而DMV的5-HT2A受體卻沒有參與此效應。結(jié)合第一部分結(jié)果,我們又設計了以下實驗。

2.3 LC在NRM調(diào)節(jié)胃運動中的作用

損毀LC后刺激NRM,胃收縮幅度在前10min降低了5.27%±6.50%,而在后30min分別升高了4.73%±1.90%、12.65%±4.78%和 18.90%±6.65%,與單純刺激NRM組比較在前10min內(nèi)有顯著性差異(P<0.05,圖4A),而在后30min有極顯著差異(n=10,P<0.01,圖4A)。

LC內(nèi)微量注射5-HT2A受體阻斷劑利醅酮,在前20min內(nèi)使胃收縮幅度顯著增強了22.37%±7.60%和 16.93% ±5.47%(P<0.05,圖 4B);與注射溶劑的對照組比較在40min內(nèi)幅度均極顯著增強(n=10,P<0.01,圖4B)。此時再刺激NRM,胃收縮幅度與單純注射利醅酮組比較無顯著性差異(34.41%±11.55%、32.96%±11.20%、26.84% ±9.80%和29.45%±10.06%,P>0.05)。

Fig.4 Regulation of NRMon gastric motilityvia5-HT2A receptor in LC

3 討論

已有研究表明,束縛浸水應激引起的胃運動和分泌功能紊亂與DMV密切相關(guān)[5]。而消化道肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)內(nèi)幾乎所有的神經(jīng)元都接受DMV的投射,該迷走末梢多與肌間神經(jīng)叢內(nèi)的中型和伸長型神經(jīng)元聯(lián)系[6]。DMV微量注射 G lu,可通過胃內(nèi)肌間神經(jīng)叢膽堿能或NO/VIP神經(jīng)元引起胃的收縮和舒張[7]。我們的研究進一步證實了在中樞對胃運動的調(diào)控中,DMV綜合中樞信息、傳出外周信息的重要地位。

胃擴張刺激可引起LC c-fos表達的增強[8],而外周注射Apetin-12對胃酸分泌的調(diào)節(jié)也有LC的參與[9]。我們的結(jié)果顯示,刺激LC顯著降低胃收縮幅度,而損毀DMV可以減弱此效應,說明LC對胃運動的調(diào)節(jié)部分通過了DMV(圖1A)。阻斷DMV的腎上腺素能α受體,發(fā)現(xiàn)可以反轉(zhuǎn)刺激LC所引起的抑胃效應,且可以進一步增強胃運動(圖1B)。由此可見,LC通過DMV的α受體發(fā)揮抑制胃運動的效應,該途徑可能是LC-DMV調(diào)控胃運動的途徑之一。LC對DMV中胃運動神經(jīng)元具有雙重調(diào)節(jié)作用,除α受體抑制途徑外,還可能有興奮性途徑。該興奮性途徑可能是通過腎上腺素能其他受體亞型起作用,也可能是非腎上腺素能中間神經(jīng)元介導的。因此,當阻斷α受體抑制性途徑后,刺激LC可以增強胃的運動。

結(jié)合第二部分實驗得到的結(jié)果,阻斷DMV上的5-HT2A受體,胃收縮幅度大幅度減弱(圖2B),說明DMV中的5-HT2A受體對胃運動的調(diào)節(jié)尤其在生理條件下正常胃的運動起重要作用。已有的研究顯示,LC內(nèi)有5-HT能神經(jīng)元存在,因此,源自此處的5-HT能神經(jīng)元與DMV上的5-HT2A受體系統(tǒng)可能是LC對DMV胃運動神經(jīng)元的興奮性途徑之一(圖5)。

有研究表明,NRM注射5-HT可通過縫脊下行途徑抑制胃運動和胃電[10]。我們的研究結(jié)果也顯示,刺激NRM對胃收縮幅度有顯著的減弱效應,但在損毀了DMV后此效應被消除,由此說明NRM對胃運動的減弱效應通過DMV實現(xiàn)(圖2A)。但是阻斷DMV上5-HT2A受體后再刺激NRM,發(fā)現(xiàn)其效應與單純刺激NRM無顯著性差異(圖2B),由此可見,NRM并不是通過5-HT能纖維直接投射到DMV,作用于5-HT2A受體來抑制胃運動的。

那么,NRM是如何間接的通過DMV發(fā)揮其抑胃效應的?進一步的研究發(fā)現(xiàn),損毀LC后刺激NRM,消除了NRM的抑胃效應(圖4A),在LC注射5-HT2A受體阻斷劑也可以消除該效應(圖4B),推測NRM對胃運動的抑制效應是通過LC上的5-HT2A受體起作用的。而NRM通過LC和DMV抑制胃運動的關(guān)鍵也是依賴于LC上的5-HT2A受體。

綜上所述,刺激LC,一方面增加NE在DMV的釋放,NE作用于DMV上的腎上腺素能α受體抑制胃活動;另一方面,也可能激活LC的5-HT能神經(jīng)元釋放5-HT,通過5-HT2A受體加強胃活動。在正常生理條件下,兩個系統(tǒng)互相牽制、共同協(xié)作,在DMV水平調(diào)節(jié)著胃收縮幅度和平均胃內(nèi)壓,維持著胃的機能狀態(tài)(圖5)。NRM中5-HT能神經(jīng)元末梢抵達LC,經(jīng)5-HT2A受體激活LC神經(jīng)元,LC中NE能神經(jīng)元釋放的NE遞質(zhì)與DMV上的腎上腺素能α受體結(jié)合,抑制DMV中的胃運動神經(jīng)元,從而對胃運動產(chǎn)生抑制作用(圖5)。

Fig.5 Relationship among LC,NRM and DMV in the regulation on gastric motility

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