季文萱，黃俊彥*，孟冬梅，劉鳳娟

(1青島市中心醫(yī)院，青島266042;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東省代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266003)

馬兜鈴酸(AA)是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物所含的成分，含AA成分的中藥曾在國(guó)內(nèi)外用于治療多種疾病，后因發(fā)現(xiàn)其有致突變、致腫瘤和腎毒性等而引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注［1］。服用含AA中草藥導(dǎo)致的腎損害［即馬兜鈴酸腎病(AAN)］是一種特殊的腎小管—間質(zhì)損害，其主要表現(xiàn)為進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化;該病發(fā)展迅速，急性者數(shù)月或數(shù)年即可發(fā)展為終末期腎功能衰竭，國(guó)內(nèi)發(fā)病率較高［2］，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，細(xì)胞凋亡與AAN發(fā)病關(guān)系密切;氧化應(yīng)激可使機(jī)體處于易損狀態(tài)，同時(shí)能增強(qiáng)致病因素的毒性作用，導(dǎo)致基因突變，它不僅與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［3］。目前，對(duì)AAN發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激作用的研究少見(jiàn)報(bào)道。2010～2011年，我們觀察了AA對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)氧化應(yīng)激的效應(yīng)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 AA(美國(guó)Sigma公司)，噻唑藍(lán)試劑盒(Amresco公司)，Annexin-V試劑盒(Invitrogen公司)，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所。HK-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%青霉素+鏈霉素的DMEM，在HamsF-12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃、濕度100%，實(shí)驗(yàn)前24 h更換無(wú)血清培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分兩組，對(duì)照組不加任何藥物;AA組在培養(yǎng)液中加入AA終濃度20 μg/ml。兩組血清濃度一致，培養(yǎng)48 h后終止實(shí)驗(yàn)，每一實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 留取各培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用刮匙收集細(xì)胞后分別與原培養(yǎng)液混合，離心棄上清;細(xì)胞沉淀后加2.5%戊二醛4℃固定4 h;然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min;1%鋨酸4℃后固定2 h;PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min;乙醇系列梯度脫水，30%、50%、70%、90%、100%的濃度每次10 min(其中100%2次)。再用Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，置37℃、45℃、65℃溫箱固化，每級(jí)溫度24 h。用UltracutE超薄切片機(jī)半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，半薄定位。UltracutE超薄切片機(jī)超薄切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色;最后用透射電鏡觀察HK-2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，拍照讀片。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 細(xì)胞活性 將細(xì)胞培養(yǎng)液置入96孔板，3×104細(xì)胞/200 μl，5%CO2、37 ℃孵育，至細(xì)胞 80%以上融合，更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入AA，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，5%CO2，37 ℃孵育48 h，在倒置顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞活性。分別于實(shí)驗(yàn)終止前4 h，在每孔加入 MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)時(shí)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處測(cè)量各孔的OD值。

1.2.4 HK-2細(xì)胞凋亡情況 收集細(xì)胞1×106個(gè)/ml，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，用 PBS 重懸細(xì)胞。按照Annexin-V FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞DNA含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液于25 ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，分組處理HK-2細(xì)胞48 h;用含EDTA的胰酶消化并獲取各組1×106個(gè)/ml細(xì)胞，用PBS沖洗1次，棄上清，用70%乙醇固定，4℃保存14 h以上;離心去除固定液后，用PBS洗2次，加入2 g/L核糖核酸酶A，在37℃下溫育30 min;再加入50 μg/ml的非低滲碘化丙啶4℃孵育20 min，用流式細(xì)胞儀獲取1×104個(gè)細(xì)胞檢測(cè)DNA含量，分析G0/G1期峰前DNA含量占細(xì)胞總DNA含量的百分比，檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。

1.2.6 氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo) 收集兩組細(xì)胞，用胰酶消化后，用PBS沖洗3遍，反復(fù)凍融，制成細(xì)胞裂解液，高速離心后取適量上清液;應(yīng)用比色法檢測(cè)MDA、GSH-PX活力，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活力，分別按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)，蛋白質(zhì)定量用考馬斯亮藍(lán)法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SSPS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞大體及超微結(jié)構(gòu) 與對(duì)照組比較，AA組培養(yǎng)48 h后，其脫落細(xì)胞數(shù)量明顯增加，大量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整;透射電鏡觀察顯示，AA組細(xì)胞出現(xiàn)體積變小、染色質(zhì)凝集或邊集等改變，部分細(xì)胞出現(xiàn)崩解、壞死。

2.2 細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡比例 與對(duì)照組比較，AA組培養(yǎng)48 h后，HK-2細(xì)胞活性明顯受抑制，凋亡細(xì)胞比例明顯增加(見(jiàn)表1)。

2.3 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率 AA組細(xì)胞凋亡率為(29.39 ±0.83)%，對(duì)照組為(5.03 ±0.26)%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。AA組作用于HK-2細(xì)胞48 h后，G0/G1、G2/M、S期細(xì)胞比例發(fā)生變化，在G2/M期發(fā)生細(xì)胞阻滯。

2.4 兩組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡比例及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(±s)

表1 兩組細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡比例及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，△P ＜0.05

組別 細(xì)胞活性(A值)凋亡細(xì)胞比例(%)MDA(nmol/mg)GSH-PX(U)SOD(U/mg)對(duì)照組 0.83 ±0.03 5.03 ±0.26 2.19 ±0.12 72.33 ±1.77 80.01 ±1.53 AA 組 0.46±0.11△ 29.39 ±0.83△ 3.55 ±0.19△ 40.06±1.59△ 27.14±1.93△

3 討論

AAN的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，以往研究多集中在腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞凋亡及AA-DNA加合物等方面，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)的研究少見(jiàn)報(bào)道［4］。

氧化應(yīng)激不僅與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［5］。正常情況下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài);當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失去平衡可出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)組織的細(xì)胞活性氧升高超過(guò)其清除能力，可引起脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，導(dǎo)致DNA氧化損傷、蛋白質(zhì)表達(dá)異常、細(xì)胞凋亡及組織損傷，造成機(jī)體損害，甚至發(fā)生腫瘤。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，可通過(guò)多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)引起細(xì)胞損傷。GSH-PX是體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解酶，可特異地催化還原型谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起重要作用，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷［6］。本研究表明，不同劑量的AA可引起腎小管上皮細(xì)胞不同程度、不同類型的結(jié)構(gòu)改變，使腎小管上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞大量缺失和腎小管萎縮。與對(duì)照組比較，AA組HK-2細(xì)胞MDA升高，GSH-PX、SOD活力明顯下降。表明AA可降低HK-2細(xì)胞的抗氧化酶活性，造成其抗氧化能力下降，氧自由基產(chǎn)生增多，自由基及其產(chǎn)物清除障礙，導(dǎo)致氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)，造成多不飽和酸的脂質(zhì)過(guò)氧化。AA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制與其導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，AA通過(guò)氧化應(yīng)激途徑能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激可能參與AAN的發(fā)病過(guò)程。目前，對(duì)AA本身還是在其代謝過(guò)程中，抑或代謝終產(chǎn)物或綜合上述原因造成的氧化應(yīng)激損傷尚不明了。防治氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的損傷可能是治療AAN的新手段，并有助于進(jìn)一步研究AAN的發(fā)病機(jī)制。

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