包翠芳，魏 嘉，梁 佳，包翠芬，閔連秋

(1錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州121000;2遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;3遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

缺血性腦病(HIE)是指局部腦組織缺血、缺氧后引發(fā)的病理過程，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死，是HIE患者致殘、死亡的常見原因。前列地爾有擴(kuò)張血管、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，該藥還有神經(jīng)保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不清楚。為探討前列地爾對局灶性腦缺血大鼠大腦皮層磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和磷酸化c-Jun(p-c-Jun)表達(dá)的影響，分析其抗腦缺血損傷機(jī)制，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及試劑 SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g;前列地爾脂肪乳劑(北京泰德制藥公司)，尼莫地平注射液(山西亞寶藥業(yè));兔抗大鼠p-JNK、p-c-Jun單克隆抗體(SANTA CRUZ公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、缺血對照組(B組)、前列地爾治療組(C組)、陽性藥物對照組(D組)，其中C組又分為前列地爾 1.25 μg/kg(C1 組)、2.50 μg/kg(C2 組)、5.00 μg/kg(C3組)三個亞組，每組5只。術(shù)前5 d至取材當(dāng)日，C組腹腔注射前列地爾，D組注射尼莫地平，其余各組注射等量生理鹽水。

1.2.2 HIE模型制備 采用改良線栓法制備HIE模型。自大鼠右頸總動脈剪一小口，置入直徑0.20～0.26 mm的線栓，從頸總動脈分叉處計算，進(jìn)線深度18～20 mm，直至大腦中動脈起始部，以完全阻斷血供。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)霍納征。A組除不置入線栓外，其他步驟同上。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 大鼠蘇醒后，參考Longa等［1］制定的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，對其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。0分示無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀;1分示不能完全伸展左側(cè)前爪;2分示向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分示行走時向左側(cè)傾倒;4分示不能自動行走，意識下降。

1.2.4 免疫組化染色 各組缺血6 h后，采用4%多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，石蠟包埋，5 μm切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，行免疫組化Envision法染色。p-JNK和p-c-Jun陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色。采用CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)檢測每個視野p-JNK、p-c-Jun陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較用t檢驗(yàn)、單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組神經(jīng)功能缺損評分及大腦皮層p-JNK、p-c-Jun表達(dá)陽性率比較見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分及大腦皮層p-JNK、p-c-Jun表達(dá)陽性率比較(±s)

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分及大腦皮層p-JNK、p-c-Jun表達(dá)陽性率比較(±s)

注:與A 組比較，*P ＜0.05;與B組比較，△P ＜0.05;與C2組比較，▲P ＜0.05;與 D 組比較，#P ＜0.05

組別 n 神經(jīng)功能缺損評分(分)p-JNK表達(dá)陽性率(%)p-c-Jun表達(dá)陽性率(%)A 組 5 0.00 ±0.00△▲2.30 ±1.90 8.06 ± 5.81 B 組 5 3.00 ±0.63＊▲# 24.86 ±6.46＊▲# 44.49 ±16.07＊▲#C1 組 5 2.00 ±0.63＊▲# 21.54 ±6.92＊△▲# 37.09 ±13.98＊△▲#C2 組 5 1.67±0.52＊△ 14.83±5.01＊△ 26.56±10.43＊△C3 組 5 1.17±0.75＊△ 8.35±4.03＊△▲# 16.52± 7.77＊△▲#D 組 5 1.20 ±0.42＊△ 12.83 ±4.15＊△ 22.69 ± 7.63＊△

3 討論

近年研究表明，前列地爾除有改善血流動力學(xué)、擴(kuò)血管等作用外，還能有效地減輕心肌、肝臟、腦組織等缺血缺氧狀態(tài)。劉暢等［2］研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾預(yù)處理對大鼠心肌損傷有早期和延遲保護(hù)作用。另外，前列地爾還可有效地抑制肝缺血后的細(xì)胞凋亡，保護(hù)移植肝，緩解長時間冷保存引起的缺血再灌注損傷，延長受體存活時間［3］;明顯降低肝缺血后的ALT、AST、TNF-α，減輕肝臟缺血再灌注損傷程度［4］。田步先等研究顯示，前列地爾預(yù)處理后，局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)缺損癥狀明顯改善，腦梗死灶明顯縮小，腦水腫程度減輕，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。以上研究表明，前列地爾可有效地抑制缺血缺氧所致的細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制尚不清楚。

現(xiàn)已明確，絲裂原活化蛋白激酶超家族成員JNK是體內(nèi)主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子之一，其通過活化下游效應(yīng)分子p-c-Jun等引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腦缺血損傷時JNK被激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致缺血性損傷。因此，抑制JNK通路活化有望成為腦缺血損傷的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀，偶見少量p-JNK、p-c-Jun陽性細(xì)胞;缺血對照組有明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，其p-JNK、p-c-Jun陽性細(xì)胞明顯增多，與文獻(xiàn)報道［5］基本一致。經(jīng)前列地爾處理后，p-JNK、p-c-Jun陽性細(xì)胞明顯減少，提示前列地爾可能通過抑制JNK蛋白及其下游效應(yīng)分子p-c-Jun活化，抑制局灶性腦缺血損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮缺血性腦損傷的保護(hù)作用;還提示前列地爾在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面具有劑量—效應(yīng)關(guān)系，即在一定范圍內(nèi)，隨著藥物劑量增加，其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用明顯。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

［2］劉暢，梅晰凡，陶貴周，等.前列地爾預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)性作用［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2009，15(3):286-289.

［3］王軍，錢海鑫，秦磊，等.前列地爾對大鼠移植肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(1)69-71.

［4］賈紅燕，李輝宇，趙浩亮.前列地爾注射液對犬肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，41(1):8-10.

［5］Gao Y，Signore AP，Yin W，et al.Neuroprotection against focal ischemic brain injury by inhibition of c-Jun Nterminal kinase and attenuation of the mitochondrial apoptosis signaling pathway［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(6):694-712.