徐長中，吳 樂，唐金榮，蘇建華，肖 杭

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029;2灌南縣人民醫(yī)院;3南京醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)毒理研究所)

c-fos是第三信使，可在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。以往認(rèn)為，神經(jīng)干損傷早期c-fos表達(dá)增加是參與沖動傳導(dǎo)軸突對傷害性刺激的反應(yīng)［1］;采用一定形式刺激神經(jīng)干，檢測c-fos表達(dá)部位及程度，可了解神經(jīng)受損狀態(tài)［2］。研究證實，刺激興奮性氨基酸受體可增加Ca2+通道開放，增加Ca2+內(nèi)流;不同性質(zhì)的致病因子最終均可導(dǎo)致第二信使Ca2+內(nèi)流，使神經(jīng)細(xì)胞功能受損［3］。早期使用鈣通道阻滯劑(CCB)可保護(hù)受損細(xì)胞的重要功能［4］，但其確切機(jī)制不明。2003～2005年，為探討CCB對大鼠坐骨神經(jīng)損害的保護(hù)機(jī)制，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及試劑 SD大鼠288只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物公司提供。禁食12 h后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組(A組)、生理鹽水組(B組)、氟桂利嗪低劑量組(C1組)與高劑量組(C2組)各72只。CCB為氟桂利嗪(西安楊森)，試劑為Trizol試劑(Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 周圍神經(jīng)損傷模型制作 模型制作前30 min，C1組、C2組分別腹腔注射氟桂利嗪1、2 mg/kg，B組注射等量生理鹽水。大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，于右后肢后側(cè)切開，鈍性分離肌肉組織，暴露坐骨神經(jīng)。其中A組在坐骨神經(jīng)暴露后關(guān)閉切口;其余三組用大鼠平均體質(zhì)量1/2的壓力夾住，持續(xù)30 s后松開，關(guān)閉切口。各組均注射抗生素預(yù)防感染。

1.2.2 背根神經(jīng)節(jié)(DRG)、坐骨神經(jīng)干分離 在實驗0、5、15、30 min，1、2、4、24 h 及4 周時分別快速處死大鼠8只，取出胸腰段脊柱。從脊柱正中剖為兩半，置于pH 7.4、滲透壓340 mOsm/L的DMEM液培養(yǎng)皿內(nèi)。遂即從椎管內(nèi)側(cè)取出脊髓、神經(jīng)節(jié)、相連的神經(jīng)前后根和坐骨神經(jīng)干，在顯微鏡下用精細(xì)角膜剪及游絲鑷剪除與神經(jīng)干相連的周圍結(jié)締組織膜。

1.2.3 c-fos mRNA檢測 嵌壓大鼠坐骨神經(jīng)后0、5、15、30 min 及1、2、4、24 h 取各組 DRG，按試劑盒操作說明提取DRG RNA。采用RT-PCR方法檢測c-fos mRNA，引物序列:c-fos上游為5'-ATGATGTTCTCGGGTTTCAA-3'，下 游 為 5'-TGACATGGTCTTCACCACTC-3'，擴(kuò)增片段長度為348 bp;c-jun上游為 5'-ATGACTGCAAAGATGGAAAC-3'，下游為 5'-TTGAAGTTGCTGAGGTTGG-3'，擴(kuò)增片段長度為530 bp。內(nèi)對照β-actin引物由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成，擴(kuò)增片段長度為877 bp。將提取后的RNA在70℃孵育10 min后置于冰上備用，配制RT反應(yīng)液20 μl，按 30 ℃ 10 min、42 ℃ 5 min、95 ℃ 5 min、5℃5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT完成后配制PCR反應(yīng)液，按95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃變性1 min、55.5 ℃(c-fos)/56℃(c-jun)退火1 min、72℃延伸1 min進(jìn)行擴(kuò)增，共循環(huán)35次，最后72℃延伸2 min。反應(yīng)完畢，將PCR產(chǎn)物加入加樣緩沖液，置1%瓊脂糖凝膠、80 V恒壓電泳30 min后，在紫外光燈下進(jìn)行陽性條帶密度掃描，計算c-fos mRNA表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果經(jīng)圖像分析軟件作半定量分析。

1.2.4 DRG的病理學(xué)檢測 第4周末處死各組大鼠，按本文1.2.2方法取出其DRG及坐骨神經(jīng)，在光鏡下檢查其病理變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-fos mRNA表達(dá) 各組0、5、15 min時的c-fos mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P均 ＞0.05);其0、30 min及1、2 h的c-fos mRNA表達(dá)見表1。

表1 各組0、30 min及1、2 h的 c-fos mRNA表達(dá)(±s)

表1 各組0、30 min及1、2 h的 c-fos mRNA表達(dá)(±s)

注:與同組0 min比較，*P ＜0.05;與 A組同期比較，△P ＜0.01;與 B 組同期比較，#P ＜0.01;與 C1組同期比較，▲P ＜0.05

檢測時間 A組(n=8) B組(n=8) C1組(n=8) C2組(n=8)0 min 18.875 ±3.271 18.750 ± 3.694 18.375 ±3.73919.000 ±4.106 30 min 19.000 ±3.665 53.250 ±11.817＊△ 47.000 ±4.876＊△# 34.375 ±6.255＊△#▲1 h 18.250 ±3.882 61.250 ±12.646＊△ 50.125 ±9.761＊△# 37.125 ±9.598＊△#▲2 h 18.375 ±4.868 47.375 ±10.623＊△ 38.500 ±7.407＊△# 30.250 ±8.049＊△#▲

2.2 DRG的病理改變 A組未見明顯病理改變。B組表現(xiàn)為眾多細(xì)胞核電子密度減低，核仁、核結(jié)構(gòu)消失，空泡變性，核膜不完整;胞質(zhì)中電子密度增加，片塊狀均質(zhì)性變和空泡變性;可見凋亡小體。C1組、C2組表現(xiàn)為少數(shù)細(xì)胞核電子密度減低，核仁、核結(jié)構(gòu)消失，空泡變性，核膜不完整;胞質(zhì)中電子密度增加，片塊狀均質(zhì)性變和空泡變性;偶見凋亡小體。C2組病變輕于C1組。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，c-fos表達(dá)升高是參與沖動傳導(dǎo)軸突對傷害性刺激的反應(yīng)［1］;壓迫L5神經(jīng)根可致c-fos表達(dá)升高［5］;阻斷 N-甲基-D-天冬氨酸門控型及 L型 Ca2+通道可下調(diào)新紋狀體早期 c-fos表達(dá)［6］;CCB及細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑可使大腦皮質(zhì)細(xì)胞損傷后大鼠早期c-fos表達(dá)下調(diào)。本研究顯示，嵌壓大鼠坐骨神經(jīng)干后，其c-fos表達(dá)升高后迅速下降;與B組比較，C1、C2組的c-fos mRNA及c-fos蛋白表達(dá)降低，以C2組顯著;其可能機(jī)制是Ca2+激活或上調(diào)c-fos表達(dá)，而CCB氟桂利嗪阻斷了Ca2+內(nèi)流，故使早期DRG細(xì)胞c-fos表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道［1～3］相近。Patro等發(fā)現(xiàn)，氟桂利嗪能使大鼠DRG神經(jīng)元丟失明顯減少。本研究顯示，CCB可減輕大鼠急性坐骨神經(jīng)嵌壓性損傷后的病理損害，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù);結(jié)果與Patro等報道相近。本研究還顯示，大鼠坐骨神經(jīng)嵌壓性損傷早期，c-fos表達(dá)可影響后期的病理學(xué)變化和神經(jīng)傳導(dǎo)恢復(fù)，c-fos表達(dá)愈高，病理損害愈重;氟桂利嗪預(yù)處理后其病理變化和神經(jīng)傳導(dǎo)改善明顯，可能與CCB阻斷Ca2+內(nèi)流，使早期c-fos表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，利用一定形式刺激神經(jīng)干，通過檢測c-fos表達(dá)的部位及程度可了解其神經(jīng)受損狀態(tài)［3］。Matthews等［7］指出，電壓依賴性 Ca2+通道活性是維持神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)元興奮性的關(guān)鍵，早期使用CCB可保護(hù)受損神經(jīng)元的重要功能。本研究顯示，大鼠坐骨神經(jīng)嵌壓性損傷早期Ca2+內(nèi)流致c-fos表達(dá)上調(diào)，及早應(yīng)用CCB可下調(diào)其神經(jīng)細(xì)胞cfos表達(dá)，從而減輕神經(jīng)病理損害，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

［1］Narita M，Ozaki S，Narita M，et al.Change in the expression of cfos in the rat brain following sciatic nerve legation［J］.Neurosci Lett，2003，352(3):231-233.

［2］Kominato Y，Tachibana T，Dai Y，et al.Change in phosphorylation of ERK and Fos expression in dorsal horn neurons following noxious stimulation in a rat model of neuritis of the nerve root［J］.Brain Res，2003，967(1-2):89-97.

［3］楊大志，王坤正，陳君長，等.神經(jīng)根嵌壓傷中原癌基因形態(tài)蛋白和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)［J］.中華外科雜志，2004，42(20):1236-1239.

［4］MacDonald JF，Xiong ZG，Jackson MF.Paradox of Ca2+signaling，cell death and stroke［J］.Trends Neurosci，2006，29(2):75-81.

［5］Tang JG，Chen HS，Yuan W，et al.The role of capsaicin-sensitive primary afferents in experimental sciatica induced by disc herniation in rats［J］.Spine，2008，33(2):163-168.

［6］Lee J，Rushlow WJ，Rajakumar N.L-type calcium channel blockade on haloperidol-induced c-Fos expression in the striatum［J］.Neuroscience，2007，149(3):602-616.

［7］Matthews EA，Dickenson AH.Effects spinally delivered N-and ptype voltage-dependent calcium channel antagonists on dorsal horn neuronal responses in a rat model of neuropathy［J］.Pain，2001，92(1-2):235-246.