楊淑先，王立萍（河南省食品藥品檢驗所，鄭州市 450003）

《中國藥典》2005年版收載的乙酰螺旋霉素組分含量采用高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法測定，對系統(tǒng)適用性試驗的規(guī)定為:“理論板數(shù)按單乙酰螺旋霉素Ⅲ組分峰計算應(yīng)不低于1000；單乙酰螺旋霉素Ⅲ組分峰與雙乙酰螺旋霉素Ⅱ組分峰的分離度應(yīng)符合要求”[1]。該方法實施以來，發(fā)現(xiàn)部分樣品經(jīng)不同實驗室采用不同的色譜柱會得出不同的測定結(jié)果，甚至按照《中國藥典》2005年版的方法和要求進行試驗，分別采用舊批乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號:0347-9702，4組分含量:90.2%）和現(xiàn)批乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號:130347-200403，4組分含量:78.3%）測定乙酰螺旋霉素原料藥及制劑，結(jié)果采用現(xiàn)批標(biāo)準(zhǔn)品比采用舊批標(biāo)準(zhǔn)品對同一樣品的測定結(jié)果偏低約4%左右。并且，生產(chǎn)單位也經(jīng)常為售出的同一批產(chǎn)品組分含量檢查結(jié)果與其他實驗室結(jié)果有差異而產(chǎn)生分歧。為此，本所、生產(chǎn)單位及相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)部門對其原因進行了系統(tǒng)的分析。經(jīng)一系列對比試驗之后，發(fā)現(xiàn)測定系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)品的分離情況對測定結(jié)果的影響較大，因此，本所通過考察不同色譜柱的分離效果，以是否達到“標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)圖譜”作為“系統(tǒng)適用性”控制依據(jù)，從而使各組分得到良好的分離[2]，使同一樣品采用不同的色譜柱測得的各組分的含量和總組分的含量的結(jié)果基本一致。同時，在《中國藥典》2010年版中，對乙酰螺旋霉素及其制劑系統(tǒng)適用性相關(guān)內(nèi)容進行了修訂。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695 HPLC儀、2996二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號:130347-200403，4組分含量:78.3%）；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

乙酰螺旋霉素原料及其制劑來源及規(guī)格等詳見表1。

表1 樣品來源及規(guī)格Tab 1 Source and specifications of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相:乙腈-0.1mol·L－1的醋酸銨溶液（60∶40，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.3）；流速:0.8 mL·min－1；柱溫:30 ℃；檢測波長:232 nm。

2.2 分析方法

采用4款C18填料的色譜柱A、B、C、D，規(guī)格均為:250 mm×4.6 mm，參照上述色譜條件，對不同批次樣品中各個組分含量進行測定，并考察組分間的分離度和柱效。根據(jù)中國藥品生物制品檢定所提供的乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品的參考圖譜（批號:130347-200403）進行判斷。標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖1。

圖1 乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig 1 HPLC chromatograms of acetylspiramycin standard

2.3 各組分含量

樣品中4組分含量和組分單Ⅱ＋單Ⅲ、雙Ⅱ＋雙Ⅲ含量測定結(jié)果分別見表2、表3、表4（其中采用色譜柱A測定了2次，結(jié)果分別記為A1、A2）。

表2 4組分含量測定結(jié)果（%）Tab 2 Results of content determination of 4 components（%）

從表2、表3、表4可知:色譜柱A第1次測定結(jié)果中，有些數(shù)據(jù)，比如表1原料中批號為080327、080210260、0802058的結(jié)果，超過試驗的誤差范圍，與其他3種色譜柱測定的結(jié)果差異較大。通過對比圖譜分析發(fā)現(xiàn)，該色譜柱中各組分的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較時間有漂移，從而造成差異，因此，組分測定時也應(yīng)該確保色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，以減小誤差。

2.4 各組分分離度和柱效

采用不同色譜柱時各組分間的分離度結(jié)果見表5、表6（表中“單Ⅱ單Ⅲ”是指單Ⅱ與單Ⅲ間的分離度，其他同理），柱效結(jié)果見表7、表8。

從表5、表6、表7、表8可見:要達到良好的分離，即各組分（單Ⅲ與雙Ⅱ、雙Ⅱ與雙Ⅲ之間）雜質(zhì)的分離個數(shù)、雜質(zhì)的基線分離和4個組分峰后的雜質(zhì)的個數(shù)不但完全一致且完全分離出來，則要求組分間的分離度均遠遠大于液相色譜的系統(tǒng)適用性要求的通用標(biāo)準(zhǔn)（1.5），如果分離度只達到1.5，就達不到上述的良好分離效果，有些雜質(zhì)峰可能包含在組分峰中而未分離出來；為確保色譜柱的分離效能，要求最終分離的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照，應(yīng)達到標(biāo)準(zhǔn)圖譜的要求或比標(biāo)準(zhǔn)圖譜分離得更好。

表3 組分單Ⅱ+單Ⅲ的含量測定結(jié)果（%）Tab 3 Results of content determination of singⅡ+singⅢ（%）

表4 組分雙Ⅱ+雙Ⅲ的含量測定結(jié)果（%）Tab 4 Results of content determination of doubleⅡ+doubleⅢ（%）

3 討論

在測定各組分含量時，由于采用色譜柱A第1次試驗時部分數(shù)據(jù)與其他色譜柱數(shù)據(jù)差異較大，故再測定了1次。A1部分數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)有差異的原因是因為保留時間有漂移，而漂移的發(fā)生與儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)，其會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，特別是當(dāng)測定的批次多、系統(tǒng)運行時間較長時。因此，組分測定時除色譜系統(tǒng)應(yīng)充分穩(wěn)定外，還應(yīng)消除環(huán)境溫度變化的影響。本身該品種每次進樣的運行時間較長，也是容易發(fā)生漂移的原因之一。因此，進行組分測定計算時，應(yīng)注意各組分保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品保持一致，否則會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表5 采用A、B色譜柱時各組分間的分離度Tab 5 Separation of the compositions（columnAand B）

表6 采用C、D色譜柱時各組分間的分離度Tab 6 Separation of the compositions（column C and D）

乙酰螺旋霉素組分復(fù)雜，組分間小雜質(zhì)較多，本身在含量測定時就容易存在誤差，如果不能保證足夠的雜質(zhì)分離，誤差將更大。從本試驗考察的數(shù)據(jù)可以看出，要達到4個組分之間有足夠的分離度，才能夠保證主組分與雜質(zhì)的完全分離。本試驗4組分的柱效都達到10000以上，且組分間的分離度超過8.0，因此對色譜柱的性能要求較高。如果按照2005年版《中國藥典》只要求常規(guī)的分離度1.5即可，那么，標(biāo)準(zhǔn)品就可能不能分離出單Ⅲ與雙Ⅱ之間的4個雜質(zhì)峰，4個雜質(zhì)峰也可能達不到基線分離。

由于乙酰螺旋霉素成分的復(fù)雜性，為便于標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在測定過程中的組分定位以及判斷各組分之間的分離狀況，《中國藥典》2010年版已將該項下的系統(tǒng)適用性規(guī)定為“記錄的色譜圖應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致”[2]，只有分離情況（各組分之間分離雜質(zhì)的個數(shù)、雜質(zhì)基線分離等）與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致時，才能夠進行組分含量測定，以減少不同分離狀態(tài)（比如組分之間的雜質(zhì)分離個數(shù)不同及主組分峰最后的雜質(zhì)峰未分離完全等）造成的結(jié)果誤差，特別是在組分邊緣時易造成對結(jié)果的誤判。

表7 采用A、B色譜柱時各組分的柱效Tab 7 Column efficiency of the compositions（column A and B）

表8 采用C、D色譜柱時各組分的柱效Tab 8 Column efficiency of the compositions（column C and D）

與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照時，應(yīng)注意組分間雜質(zhì)的個數(shù)及雙Ⅲ峰后雜質(zhì)的檢出是否完全，否則會影響后一次進樣的雜質(zhì)判斷。

由于2005年版《中國藥典》的系統(tǒng)適用性要求中，未要求檢測時與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比，這樣導(dǎo)致對同一批樣品測定時，由于分離情況的差異，出現(xiàn)不同的測定結(jié)果，因此，需要對其進行修訂及完善。

2010年版《中國藥典》已對該內(nèi)容進行了修訂，即與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照一致就是該品種2010年版《中國藥典》執(zhí)行的一個統(tǒng)一的分離衡量標(biāo)準(zhǔn)。這樣，除了試驗本身存在的誤差之外，同一批次樣品在不同實驗室測定應(yīng)該都能反映其真實含量。本試驗為2010年版《中國藥典》乙酰螺旋霉素及其制劑的修訂方法執(zhí)行提供了借鑒和依據(jù)。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:6.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:8.