鄧舒婷，甘霖，周琦，#，徐建業(yè)，李少林（.重慶市腫瘤研究所婦瘤科，重慶市40000；.重慶醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)教研室，重慶市 40006；.重慶市腫瘤研究所臨床檢驗中心，重慶市 40000）

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，病死率居婦科惡性腫瘤首位，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。以順鉑（Cisplatin，DDP）為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，能有效提高患者生存率。但因順鉑等化療毒副作用大，且長期使用會產(chǎn)生耐藥性，可能導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)。故尋找能增強(qiáng)療效并減輕化療毒副作用的藥物或化療組合，日益成為研究熱點。姜黃素（Curcumin，Cur）是從中藥姜黃中提煉出的有效成分。有研究[1～3]證實，Cur對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞系均有生長抑制作用。固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是近年來正在發(fā)展的新型納米載藥體系，可延長藥物在血液中的半衰期，有效提高藥物的生物利用度。目前，國內(nèi)、外尚未見關(guān)于姜黃素固體脂質(zhì)納米粒（Curcumin-loaded solid lipid nanoparticles，Cur-SLN）抗婦科腫瘤的研究報道。本試驗采用溶液擴(kuò)散法制備Cur-SLN，并研究其單用或與DDP聯(lián)用對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用，為今后Cur-SLN治療卵巢癌的化療臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ELX800酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；透射電鏡（日本日立公司）；流式細(xì)胞儀（上海邦逞醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

小牛血清（蘭州民海生物工程有限公司，批號:20091015）；Cur（美國Sigma公司，批號:100K3447，規(guī)格:每瓶250 mg，純度:99%）；DDP凍干滅菌粉末（山東羅欣藥業(yè)股份有限公司，批號:09061001-2，規(guī)格:每瓶10 mg）；青霉素、鏈霉素凍干滅菌粉末（華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，批號:B0501013、B050310，規(guī)格均為每瓶800 萬u）；Cur-SLN（重慶市腫瘤研究所臨床檢驗中心分子生物學(xué)實驗室自制，包封率:85.3%，載藥量:73.2%）；其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株（來源于重慶醫(yī)科大學(xué)腫瘤學(xué)教研室）。

2 方法

2.1 Cur-SLN混懸液的制備

采用溶液擴(kuò)散法，根據(jù)前期單因素考察及參考文獻(xiàn)[4]，確定較優(yōu)制備工藝。精密稱取Cur 8 mg（27 μmol）和硬脂酸80 mg溶于無水乙醇3 mL中，加熱至50℃，滴入聚乙烯醇溶液中，攪拌2 h。將所得混懸液3000 r·min－1離心3 min，蒸餾水清洗2次，再加入適量蒸餾水，超聲10 min，即得濃度為20 μmol·L－1的Cur-SLN混懸液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)在RPIM-1640培養(yǎng)液中（含10%小牛血清、100 u·mL－1青霉素及鏈霉素），置于37 ℃、5%CO2孵箱中備用。

2.3 細(xì)胞生長抑制率的檢測

采用MTT法，取SKOV3細(xì)胞常規(guī)消化并制成濃度為5×105個/mL懸液，接種于96孔板，每孔200 μL，加入不同濃度藥物，每個藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入濃度為5 mg·mL－1的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后離心去上清，加二甲基亞砜（DMSO）200 μL，充分吹打震蕩10 min，于酶標(biāo)儀上540 nm波長下測定吸光度（A）值，試驗重復(fù)3次取平均值。按下式計算細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1－實驗藥物組A/空白對照組A）×100%。

單用試驗，分組為空白對照組、Cur組及Cur-SLN組。其中空白對照組加入培養(yǎng)液20 μL；Cur組分別加入10、20、40、60、80 μmol·L－1的Cur（用蒸餾水稀釋）20 μL；Cur-SLN組分別加入10、20、40、60、80 μmol·L－1（以Cur計）的Cur-SLN 20 μL。

聯(lián)用試驗，分組為空白對照組、DDP組、DDP+Cur組及DDP+Cur-SLN組。其中空白對照組加入培養(yǎng)液20 μL；后3組中DDP終濃度均為1、2、3、4、5 μmol·L－1，加入量均為20 μL，Cur終濃度均為10 μmol·L－1（Cur-SLN濃度經(jīng)預(yù)試驗得出，約為半數(shù)抑制濃度（IC50）的1/3，為方便比較，Cur終濃度同Cur-SLN），加入量為20 μL。

2.4 細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期分布的檢測

取細(xì)胞懸液20 mL，其中細(xì)胞數(shù)為1×106個，接種于200 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)24 h，分組為空白對照組、DDP組、Cur組、Cur-SLN組、DDP+Cur組及DDP+Cur-SLN組（DDP終濃度均為2.5 μmol·L－1，Cur終濃度均為10 μmol·L－1），加入量均為20 μL，培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，3000 r·min－1離心3 min，加1 mL含2%小牛血清的PBS液混勻；用預(yù)冷75%乙醇固定，吹打成單細(xì)胞懸液，4℃放置30 min，1000 r·min－1離心20 min；加PBS液后再離心，去固定液，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布，用Modifit 1.0軟件分析結(jié)果。

2.5 細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin E、CDK2表達(dá)的檢測

細(xì)胞濃度及用量、分組同“2.4”項，接種于200 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，加PBS液清洗3次，投入冷丙酮（4℃）中，在各組培養(yǎng)瓶內(nèi)放置無菌蓋玻片培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)時，取出蓋玻片，用PBS液清洗3次，細(xì)胞面向上投入4℃冷丙酮中固定5 min，用PBS液（pH7.4）沖洗3次，每次1 min，之后以二氨基聯(lián)苯胺顯色法（DAB法）進(jìn)行細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin E、CDK2免疫組化染色，最后自來水充分沖洗，復(fù)染封片，顯微鏡下觀察、鑒定，半定量分析，測定細(xì)胞周期標(biāo)記指數(shù)（LI）。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有資料應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用表示，MTT試驗數(shù)據(jù)分析采用2×2×2析因設(shè)計的方差分析，流式技術(shù)和DAB數(shù)據(jù)分析采用2×2析因設(shè)計的方差分析，兩兩比較采用S-N-K法，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞生長抑制率檢測結(jié)果

3.1.1 單用試驗結(jié)果。隨著各組藥物濃度的增加及作用時間延長，細(xì)胞生長抑制率呈上升趨勢，并在一定范圍內(nèi)呈濃度、時間依賴性，且在同一濃度及作用時間下，Cur-SLN組較Cur組對SKOV3細(xì)胞的生長抑制作用更顯著（P＜0.05）。單用試驗各組對SKOV3細(xì)胞作用不同時間后細(xì)胞生長抑制率比較見圖1。

圖1 單用試驗各組對SKOV3細(xì)胞作用不同時間后細(xì)胞生長抑制率比較Fig 1 Comparison of inhibition rate of SKOV3 cell growth in single drug group after different treatment time

3.1.2 聯(lián)用試驗結(jié)果。（1）DDP對SKOV3細(xì)胞生長的作用。隨著濃度增加及作用時間延長，DDP對SKOV3細(xì)胞的生長抑制率均升高，呈濃度、時間依賴性。（2）DDP+Cur及DDP+Cur-SLN對SKOV3細(xì)胞生長的作用。與DDP組比較，DDP+Cur組及DDP+Cur-SLN組對SKOV3細(xì)胞的生長抑制率隨DDP濃度增加和作用時間延長均升高，其中DDP+Cur-SLN組較DDP組和DDP+Cur組升高有明顯差異（P＜0.05），呈濃度、時間依賴性。表明Cur-SLN與DDP聯(lián)用有明顯協(xié)同作用，可提高腫瘤對DDP的敏感性。聯(lián)用試驗各組對SKOV3細(xì)胞作用不同時間后細(xì)胞生長抑制率比較見圖2。

圖2 聯(lián)用試驗各組對SKOV3細(xì)胞作用不同時間后細(xì)胞生長抑制率比較Fig 2 Comparison of inhibition rate of SKOV3 cell growth in drug combination group after different treatment time

3.2 細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期分布比較

與空白對照組比較，各組均出現(xiàn)S期細(xì)胞比例逐漸降低、G2期細(xì)胞比例逐漸增加的現(xiàn)象；Cur-SLN組較Cur組發(fā)生G2期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用更顯著；當(dāng)DDP與Cur-SLN聯(lián)用時細(xì)胞凋亡率為17.94%，較DDP組（4.65%）及Cur-SLN組（7.69%）均明顯升高（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡試驗各組對SKOV3細(xì)胞周期及凋亡率影響見表1。

表1 細(xì)胞凋亡試驗各組對SKOV3細(xì)胞周期及凋亡率影響Tab 1 Effect of cell apoptosis test on cell cycle and apoptosis rate of SKOV3 cells

3.3 Cyclin E、CDK2表達(dá)結(jié)果比較

空白對照組Cyclin E、CDK2陽性表達(dá)的LI值分別為（17±3.12）%、（20±4.41）%，而 DDP 組為（26±4.18）%、（32±5.61）%，Cur組為（21±4.03）%、（23±4.73）%，Cur-SLN組為（27±5.36）%、（34±3.82）%，DDP+Cur組為（23±5.15）%、（31±4.76）%，DDP+Cur-SLN 組為（35±5.93）%、（38±6.16）%，其中DDP+Cur-SLN組較其他組陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。與空白對照組比較，各組表達(dá)均有顯著性差異（P＜0.05）。

4 討論

植物來源的抗腫瘤藥近年來在新藥開發(fā)上顯示出了巨大潛力，成為新型抗腫瘤藥物的重要來源，如Cur、紫杉醇、喜樹堿、莪術(shù)醇[5]等。Cur提取自中藥姜黃，其主要藥理作用包括抗腫瘤、抗炎、降血脂等，且毒性作用較少，對正常組織細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生不良影響[6]。近年來Cur的抗腫瘤作用成為研究熱點，機(jī)體內(nèi)部實驗證實Cur可有效抑制腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移，體外試驗證實Cur具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用[7]。Cur的抗癌譜廣且毒副作用小，美國國立癌癥研究院已將其列為第3代抗癌化學(xué)預(yù)防藥。但因Cur不溶于水，耐光性、耐熱性較差，體外易被氧化，限制了其作為抗癌新藥的研制及臨床應(yīng)用。

SLN是一種粒徑在10～1000 nm之間的新型膠體給藥系統(tǒng)。藥物可包埋或溶解在納米粒的內(nèi)部，也可吸附或偶合在其表面，具有較好的生物相容性。目前SLN有多種制備方法，如高壓乳勻法、乳化蒸發(fā)-低溫固化法、薄膜超聲法、微乳法等[8]。本文采用溶液擴(kuò)散法制備方法簡單，所制納米粒粒徑足夠小，既適于實驗室研制，也比較容易規(guī)模化生產(chǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Cur-SLN是通過誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖及促凋亡作用的。這也正是DDP等化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。研究結(jié)果顯示，Cur-SLN單用或與DDP聯(lián)用于SKOV3細(xì)胞均可起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且2藥聯(lián)用時細(xì)胞凋亡率顯著增加。Cur-SLN及DDP均可使SKOV3細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞生長，2藥聯(lián)用細(xì)胞生長抑制作用更顯著，提示Cur-SLN可以增強(qiáng)DDP對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。同時，加入Cur-SLN后的各組Cyclin E、CDK2表達(dá)較Cur組均有所升高，尤其是DDP+Cur-SLN組升高最明顯。

綜上所述，Cur-SLN對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞有明顯的生長抑制及促凋亡作用，且與DDP聯(lián)用有協(xié)同效果。本試驗為Cur抗腫瘤藥的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用、減少DDP臨床用量、降低腎毒性并提高化療效果提供新思路及試驗依據(jù)。

[1]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2007，56（2）:43.

[2]Xu J，F(xiàn)u YM，Chen AP.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma contributes to the inhibitory effects of curcumin on rat hepatic stellate cell growth[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，285（1）:20.

[3]Chen AP，Xu J，Johnson AC.Curcumin inhibitis human colon cancer cell growth by suppressing gene expression of EGFR through reducing the activity of Egr-1[J].Oncogene，2006，25（6）:278.

[4]許漢林，孫 蕓，邵繼征，等.不同方法制備姜黃素脂質(zhì)體的研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（7）:26.

[5]林 海，李曉輝.莪術(shù)醇誘導(dǎo)白血病L1210細(xì)胞凋亡作用研究[J].中國藥房，2008，19（30）:2328.

[6]Anand P，Sundaram C，Jhurani S，et al.Curcumin and cancer:an“old-age”disease with an“age-old”solution[J].Cancer Letters，2008，267（1）:133.

[7]Jing Z，Yong Z，Yan Z，et al.Anti-tumor effect of curcumin on human cervical carcinoma hela cells in vitro and in vivo[J].Chinese J Cancer Res，2007，19（1）:32.

[8]馬 艷，蔣學(xué)華，楊安東，等.薄膜超聲法制備姜黃素固體脂質(zhì)納米粒的工藝研究[J].中成藥，2008，30（7）:981.