鄭美梅，王方劍，溫武金，江 勇，段成城，潘小華（廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院呼吸內(nèi)科，深圳市 518104）

氣道重塑是支氣管哮喘的重要病理特征之一[1]，是哮喘難以控制的一個(gè)重要原因。近年來，隨著研究的深入，抑制和逆轉(zhuǎn)氣道重塑成為哮喘治療的新方向。研究[2]發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素可抑制炎癥介質(zhì)釋放，減少黏液分泌，降低氣道高反應(yīng)，減輕哮喘臨床癥狀，但能否抑制或逆轉(zhuǎn)氣道重塑尚不清楚。本課題通過復(fù)制哮喘模型小鼠，觀察阿奇霉素對(duì)其氣道上皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)及氣道重塑指標(biāo)的影響，為其在哮喘的臨床治療方面提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YC-Y800超聲霧化治療儀（北京亞都科技股份有限公司）；TDL高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；石蠟切片機(jī)（美國(guó)Optical公司）；光學(xué)顯微及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）；DC200圖像采集及分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）。

1.2 試藥

注射用乳糖酸阿奇霉素（以下簡(jiǎn)稱阿奇霉素，哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號(hào):B100501213，規(guī)格:每支0.25 g）；卵蛋白（美國(guó)Sigma公司分裝，批號(hào):A5253）；氫氧化鋁（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào):20100302，分析純）；地塞米松片（廣東江門制藥廠，批號(hào):100502，規(guī)格:每片0.75 mg）；兔抗鼠MMP-9多克隆抗體及即用型免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 動(dòng)物

BALB/c小鼠60只，SPF級(jí)，♂，8～10周齡，體重（20±3）g，由廣州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):2010A015。

2 方法

2.1 分組與給藥

取小鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性對(duì)照組（地塞米松，0.18 mg·mL－1）和阿奇霉素低、中、高劑量組（0.2、0.4、0.8 mg·mL－1），每組10只。除正常對(duì)照組外其余各組均腹腔注射0.2 mL抗原液（卵蛋白10 μg、氫氧化鋁20 mg配成100 mL），每隔2周注射1次，共3次；第3次注射1周后每天上午霧化卵蛋白30 min以激發(fā)哮喘，每日1次，連續(xù)15 d。模型組小鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快、點(diǎn)頭呼吸、鼻翼煽動(dòng)、抽搐等癥狀時(shí)示造模成功。每日霧化前1 h腹腔注射相應(yīng)藥物0.5 mL。阿奇霉素及地塞米松的用藥劑量是將成人臨床用藥量按小鼠體表面積進(jìn)行換算，得實(shí)驗(yàn)小鼠用藥劑量為10 mg·kg－1·d－1；阿奇霉素低、中、高劑量組分別相當(dāng)于臨床擬定治療劑量的20、10、5倍。

2.2 肺組織病理學(xué)變化

末次激發(fā)24 h后，處死小鼠取左肺組織，置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h后進(jìn)行脫水，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。同時(shí)右肺組織切片后擬行免疫組化處理。

2.3 氣道重塑指標(biāo)的檢測(cè)

左肺組織切片行HE染色后，400倍光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。200倍光鏡下選擇20個(gè)完整的支氣管橫斷面，圖像分析軟件測(cè)量基底膜周徑（Pbm）、支氣管總管壁面積（WAt）、氣道內(nèi)壁面積（WAi）、平滑肌面積（WAm），用Pbm將測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化（以消除管徑大小、氣道狀態(tài)以及切片方向不同等所造成的差別），分別代表總管壁厚度（WAt/Pbm）、內(nèi)壁厚度（WAi/Pbm）、平滑肌厚度（WAm/Pbm），來衡量氣道重塑程度。

2.4 氣道上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組化染色法，參照二抗試劑盒說明書進(jìn)行操作，取右肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)，一抗稀釋度為1∶100，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照，中性樹膠封片觀察。400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)取5個(gè)支氣管，用圖像分析軟件測(cè)量各組支氣管上皮細(xì)胞胞漿中MMP-9陽性表達(dá)產(chǎn)物的平均光密度（OD）值，表示支氣管上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)的相對(duì)含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 小鼠哮喘發(fā)作情況

末次激發(fā)后30 min內(nèi)，除正常對(duì)照組外其余各組小鼠均出現(xiàn)呼吸頻快、躁動(dòng)、打噴嚏等癥狀；模型組癥狀重且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、食欲下降；陽性對(duì)照組和阿奇霉素各劑量組發(fā)作程度均較輕。

3.2 肺組織病理學(xué)變化

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠氣道管腔狹窄，可見黏液栓堵塞，黏膜下層增寬，黏膜皺褶增多呈菊花狀，氣道壁及氣道平滑肌層明顯增厚，氣道上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多，黏膜下及管周可見有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而陽性對(duì)照組和阿奇霉素各劑量組上述病變較模型組均減輕。各組小鼠肺組織病理學(xué)變化見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×400）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.阿奇霉素低劑量組；D.阿奇霉素中劑量組；E.阿奇霉素高劑量組；F.陽性對(duì)照組Fig 1 Histopathological changes of mice lung in each group（HE，×400）A.normal control group；B.model group；C.azithromycin low-dose group；D.azithromycin medium-dose group；E.azithromycin high-dose group；F.positive control group

3.3 氣道重塑指標(biāo)比較

與模型組比較，陽性對(duì)照組和阿奇霉素各劑量組WAt/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm 3個(gè)指標(biāo)均明顯下降（P＜0.01），但仍顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。各組小鼠氣道重塑指標(biāo)結(jié)果比較見表1。

表1 各組小鼠氣道重塑指標(biāo)結(jié)果比較（μm2·μm－1，，n＝10）Tab 1 Comparison of airway remodeling index of mice in each grou（pμm2·μm－1，，n＝10）

表1 各組小鼠氣道重塑指標(biāo)結(jié)果比較（μm2·μm－1，，n＝10）Tab 1 Comparison of airway remodeling index of mice in each grou（pμm2·μm－1，，n＝10）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組阿奇霉素低劑量組阿奇霉素中劑量組阿奇霉素高劑量組陽性對(duì)照組WAm/Pbm 3.94±0.437.97±0.17＊5.47±0.16＊#4.75±0.35＊#4.56±0.14＊#4.39±0.34＊#WAt/Pbm 7.15±0.8315.36±0.85＊11.80±0.30＊#10.15±0.95＊#9.87±0.12＊#8.23±0.62＊#WAi/Pbm 3.40±0.4310.64±1.03＊5.21±0.57＊#4.16±0.32＊#4.08±0.27＊#3.94±0.31＊#

3.4 MMP-9表達(dá)比較

正常對(duì)照組MMP-9在氣道黏膜上皮細(xì)胞胞漿中有少量表達(dá)或不表達(dá)；模型組MMP-9在上皮細(xì)胞胞漿中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，為棕色顆粒；陽性對(duì)照組和阿奇霉素各劑量組較模型組表達(dá)均減弱，顏色變淺。各組小鼠氣道上皮細(xì)胞MMP-9免疫組化染色結(jié)果見圖2，MMP-9表達(dá)比較見表2。

圖2 各組小鼠氣道上皮細(xì)胞MMP-9免疫組化染色結(jié)果（DAB，×400）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.阿奇霉素低劑量組；D.阿奇霉素中劑量組；E.阿奇霉素高劑量組；F.陽性對(duì)照組Tab 2 Immunohistochemical staining of airway epithelial cells MMP-9（DAB，×400）A.normal control group；B.model group；C.azithromycin low-dose group；D.azithromycin medium-dose group；E.azithromycin high-dose group；F.positive control group

表2 各組小鼠氣道上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)比較（，n＝10）Fig 2 Comparison of MMP-9 expression of airway epithelial cells of mice in each grou（p，n＝10）

表2 各組小鼠氣道上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)比較（，n＝10）Fig 2 Comparison of MMP-9 expression of airway epithelial cells of mice in each grou（p，n＝10）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.05；與模型組比較:#P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.05；vs.model group:#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組阿奇霉素低劑量組阿奇霉素中劑量組阿奇霉素高劑量組陽性對(duì)照組光密度值0.76±0.161.75±0.05＊1.42±0.83＊#1.34±0.03＊#1.28±0.15＊#0.98±0.17＊#例數(shù)101010101010

4 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝的主要限速酶，與哮喘氣道重塑密切相關(guān)[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是MMP-9的生理性特異抑制劑，正常時(shí)二者以1∶1的形式分泌，MMP-9/TIMP-1比值升高會(huì)導(dǎo)致組織損傷。研究[4，5]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的肺泡灌洗液、血清及痰中的MMP-9水平明顯升高，黏膜下MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)也升高。哮喘急性發(fā)作期MMP-9占優(yōu)勢(shì)，不僅導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解和沉積紊亂，還可誘導(dǎo)以嗜酸粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞的遷移[5]及平滑肌細(xì)胞的增殖與肥大[6]，進(jìn)而引起氣道重塑。因此，抑制MMP-9的過度表達(dá)成為治療哮喘特別是難治性哮喘的重要研究方向。

本研究結(jié)果表明，阿奇霉素可能通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)，延緩氣道重塑的病理變化，從而減慢哮喘氣道重塑的進(jìn)程，但效果較地塞米松仍較弱。

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[2]Piacentini GL，Peroni DG，Bodini A，et al.Azithromycin reduces bron-chial hyperresponsiveness and neutrophilic airway inflammation in asthmatic children:a preliminary report[J].Allergy Asthma Proc，2007，28（2）:194.

[3]王家珍，吳天清，周立遠(yuǎn).Egb761對(duì)哮喘模型大鼠MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響和對(duì)氣道重構(gòu)的干預(yù)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（24）:1845.

[4]Lee YC，Lee HB，Rhee YK，et al.The involvement of matrix metalloproteinase-9 in airway inflammation of patients with acute asthma[J].Clin Exp Allergy，2001，31（10）:1623.

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