劉 斌，戚 峰，季 兵，鞏發(fā)才，劉 彤

大腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的前列，在全球呈上升趨勢[1-2]。我們通過收集本院2008年4月—2009年3月經(jīng)手術(shù)切除的60例大腸癌標本，研究大腸癌淋巴管密度與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并應用基因芯片技術(shù)分析大腸癌組織淋巴管生成的可能調(diào)控基因，為大腸癌的靶向治療提供分子生物學基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 資料 本組共60例，男32例，女28例；年齡43～80歲，中位年齡67歲。根據(jù)腫瘤所在部位行相應的腫瘤切除及淋巴結(jié)清掃。所有標本均經(jīng)病理學證實。手術(shù)前均未進行化療、放療、生物治療等。

1.2 取材 標本均采集大腸癌組織、遠癌切端腸組織黏膜，標本離體后取材并分為兩部分，一部分置入液氮速凍后再置-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠种萌?0%中性福爾馬林固定后進行石蠟包埋備用。

1.3 免疫組化染色及觀察方法 將手術(shù)切除標本以抗Podoplanin抗體（Santa Cruz公司，1∶100稀釋）為一抗進行免疫組化染色，按照Weidner等[3]報道的方法，先在低倍鏡(×40)下掃視整個視野的腫瘤區(qū)域，選擇其中的4個淋巴管密集區(qū)，然后在高倍鏡(×200)下計數(shù)其淋巴管數(shù)目，取其平均值作為該例標本的LVD值。

1.4 基因芯片分析 將標本以LVD為標準分為高密度和低密度兩組，每組隨機選取2例標本。提取4個大腸癌組織樣本mRNA，制備生物素標記的cRNA探針，與腫瘤基因芯片（OHS-802）雜交，采用化學熒光法檢測特異基因表達水平，最后行圖像采集與數(shù)據(jù)分析。芯片購自上?？党缮锕こ逃邢薰?，包含有腫瘤抑制基因、致癌基因、信號轉(zhuǎn)導分子、生長因子、生長因子受體和血管生成因子基因等480個靶基因點。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS l5.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析,計量資料采用獨立樣本t檢驗、方差分析，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織和遠癌切端大腸組織的LVD計數(shù)大腸癌組織的LVD為（17.72±6.93），遠癌切端腸組織為（8.90±2.40），二者比較具有統(tǒng)計學差異(P＜ 0.05)。

2.2 大腸癌組織LVD計數(shù)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系不同分化程度、不同浸潤深度、淋巴結(jié)陽性與陰性組的大腸癌組織LVD差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，不同年齡、性別、組織學分型間的大腸癌組織LVD無明顯差異(P＞0.05），見表1。

表1 大腸癌組織LVD與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 腫瘤基因芯片檢測 大腸癌組織4例，其中A、B為大腸癌組織Podoplanin表達強陽性，其LVD水平較高，C、D為大腸癌組織Podoplanin表達弱陽性，其LVD水平較低，見圖1。

圖1 腫瘤基因芯片掃描圖片

LVD表達高的大腸癌組織比LVD表達低的大腸癌組織上調(diào)5倍以上基因有:ERCC3,AXL,LEP,UCHL1,VEGF-A；而下調(diào)5倍以上的基因有:VHL,CDC20,MMP1,TFDP1,CDKN2A,RRM1,HMMR，KLK10,ABCB1,HSPA4,SLC1A4（見圖 2）

3 討論

圖2 聚類分析:A、B平均值/C、D平均值

常用的淋巴管識別技術(shù)包括淋巴管注射法、酶組織化學染色方法、電鏡技術(shù)、免疫組織化學方法等。免疫組織化學方法目前被認為是鑒別淋巴管內(nèi)皮細胞，尤其是與血管內(nèi)皮細胞相鑒別的最佳方法。近年來對新生淋巴管的研究逐漸增多，主要是源于其特異性標記物的發(fā)現(xiàn)，最常用的包括Podoplanin、LYVE—1和VEGFR。郭嫦媛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學技術(shù)下Podoplanin染色可以作為標記淋巴管的理想實驗方法。本研究選取手術(shù)切除大腸癌標本60例，同時取遠癌切端腸組織作為對照，并采用抗Podoplanin抗體免疫組化進行淋巴管密度的測定，證實大腸癌組織LVD顯著高于遠癌切端腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義。提示大腸癌中有大量淋巴管生成，與大多數(shù)研究的報道結(jié)果一致。同時，LVD與大腸癌患者的性別、年齡、組織學分型之間無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤的分化程度明顯相關(guān)。大腸癌中LVD在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示淋巴管數(shù)量的多少與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。大腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度是臨床上反映腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的指標，本研究顯示腫瘤的淋巴管密度與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，說明腫瘤的淋巴管密度在腫瘤的惡性進展過程中起著重要的促進作用。

大腸癌尤其是伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，術(shù)后輔助化療已成為常規(guī)。但是對于淋巴結(jié)尚無轉(zhuǎn)移的患者是否需要化療仍無統(tǒng)一的認識。蘇木精-伊紅染色病理檢查未發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Dukes-A和Dukes-B期病人，仍有10%～25%于術(shù)后5年內(nèi)復發(fā)[5]，提示存在著一種常規(guī)手段不易發(fā)現(xiàn)的腫瘤“微轉(zhuǎn)移”。從本研究中得出，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組與陰性組之間LVD有顯著差異。但是，大腸癌手術(shù)切除標本經(jīng)Podoplanin免疫組化染色，檢測腫瘤組織中淋巴管數(shù)目是否可以作為篩選此類患者的手段有待進一步研究。

眾所周知，大腸癌的發(fā)生為一多步驟、多階段過程，涉及多個基因的改變。目前普遍認為，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管和淋巴管生成中具有直接和間接的調(diào)控作用,及時地抑制VEGF能夠阻止疾病的進展[6]，VEGF-A是大部分腫瘤和組織血管生成的關(guān)鍵因子[7]。Damert等[8]報道，VEGF-A在腫瘤組織中同樣可以引起淋巴管的生成。Meit等[9]證明，VEGF-A是通過VEGF-C/-D/VEGFR-3這一通路促進淋巴管的生成，而且促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。VEGF-A可能是腫瘤生長中最常見的上調(diào)因子，因此它可能是最常見的實體腫瘤中淋巴生成因子促進淋巴轉(zhuǎn)移的因子。貝伐珠單抗注射液是VEGF抑制劑，近年研究表明在化療的基礎(chǔ)上加用此藥，通過與VEGF特異性結(jié)合，阻止其與受體相互作用，發(fā)揮對腫瘤的多種抑制作用，能更進一步提高晚期大腸癌的有效率和總生存期。本研究顯示VEGF-A是LVD表達高的大腸癌組織比LVD表達低的大腸癌組織上調(diào)5倍以上基因之一。

林希病腫瘤因子（von hippel-lindua,VHL）是公認的缺氧誘導因子的抑制因子，與HIF-1a有著復雜的相互作用，并調(diào)控其降解。VHL基因最早是作為腫瘤抑制基因被發(fā)現(xiàn)的，近年研究發(fā)現(xiàn)VHL蛋白及其mRNA失表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)[10],VHL的降低產(chǎn)生過量HIF-1a的靶基因VEGF基因，促進腫瘤淋巴管的生成。本研究顯示，VHL是LVD表達高的大腸癌組織平均值比LVD表達低的大腸癌組織平均值下調(diào)5倍以上基因之一。如果能夠研究出一種新型抗腫瘤藥物，特異性抑制腫瘤組織中VEGFA等促進淋巴管生成的基因表達，或特異性促進VHL等抑制淋巴管生成的基因表達，將為大腸癌的治療開辟一條新的途徑。因此，在基因或蛋白水平抑制某些基因的上調(diào)（如抑制VEGFA作用的環(huán)節(jié)）或下調(diào)（如增強VHL作用的環(huán)節(jié)），將有望在大腸癌的治療道路上取得突破。

由于失訪率較高，60例大腸癌患者預后及隨訪情況難以得到統(tǒng)計和分析。由于腫瘤部位所包含的細胞類型的多樣性，使得人們在解釋這些相關(guān)基因的表達變化與腫瘤中特定細胞類型的表型變化相關(guān)性時遇到一定的困難。本研究按照相關(guān)的功能挑選了部分基因，可以發(fā)現(xiàn)一些與腫瘤相關(guān)的基因表達變化。特別在原癌基因方面，不同LVD標本有不同的表達，可能與不同原癌基因在不同腫瘤發(fā)生中的作用不同有關(guān)?？梢灶A測，大量基因芯片的檢測結(jié)果對于大腸癌淋巴管生成調(diào)控基因的研究會有重要意義。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中LVD隨著原發(fā)腫瘤分化程度減低、浸潤加深以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高；高LVD的大腸癌組織與低LVD的大腸癌組織間存在差異表達的基因。

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