吳 影，李念兵

(1.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 北碚 400715;2.重慶文理學(xué)院，重慶 永川 402160)

生物電活性分子電化學(xué)行為的研究仍是當(dāng)今電化學(xué)和分析電化學(xué)中較為活躍的領(lǐng)域，愈來愈受到科研工作者的高度重視.多巴胺(Dopamine，DA)作為神經(jīng)中樞系統(tǒng)內(nèi)天然存在的一種極為重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)又能獨(dú)立存在于腦組織;然而當(dāng)腦組織內(nèi)的多巴胺神經(jīng)功能發(fā)生失調(diào)的時(shí)候，就會(huì)導(dǎo)致精神分裂癥和帕金森氏癥等惡性疾病［1-3］.這引起了眾多學(xué)者利用現(xiàn)代分析研究方法測(cè)定它在人體血液中的微量存在的濃厚興趣.國(guó)內(nèi)外分析檢測(cè)DA的主要研究手段有:熒光光度法、反相或流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法、氣相色譜-質(zhì)譜法、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法等［4-8］.然而，DA在傳統(tǒng)的Au，Ag，Pt等金屬電極和碳電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的時(shí)候，過電位頗高，響應(yīng)信號(hào)較低，容易受到電極反應(yīng)產(chǎn)物的污染，從而致使電極表面發(fā)生“鈍化”.近些年來，隨著電化學(xué)的不斷深入發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)在裸電極表面引入一層適當(dāng)?shù)陌被岜∧ぶ?，能夠增加DA在修飾電極表面的傳質(zhì)速率，從而實(shí)現(xiàn)DA的高靈敏度、高選擇性測(cè)定.本文研究了L-半胱氨酸(L-Cysteine)在玻碳電極(GCE)上的修飾條件，制備了L-半胱氨酸修飾玻碳電極，研究了在此電極上的電化學(xué)行為，實(shí)現(xiàn)了DA的伏安測(cè)定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

儀器:LK2005A電化學(xué)分析儀(中國(guó)，天津蘭力科儀器公司);pH B-4酸度計(jì);AS10200AT超聲波清洗機(jī);PG-2A機(jī)械拋光機(jī);傳統(tǒng)三電極體系:L-半胱氨酸修飾玻碳電極(L-Cys/GC電極)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲為對(duì)電極.

試劑:L-半胱氨酸(L-Cysteine，上海索寶生物技術(shù)有限公司);多巴胺(Dopamine，重慶川東化工有限公司);0.1mol/L混合磷酸鹽(PBS)緩沖溶液均由 0.2 mol/L NaH2PO4、0.2 mol/L Na2HPO4和0.1mol/L KCl儲(chǔ)備液配置，采用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L H3PO4調(diào)節(jié)至所需pH值.其它化學(xué)試劑及藥品均采購于重慶北碚化學(xué)試劑廠(分析純)，實(shí)驗(yàn)所用水為二次蒸餾水.

1.2 L-Cys/GC電極的制備方法

將玻碳電極(Φ=3mm)分別經(jīng)細(xì)金相砂子打磨光滑，機(jī)械拋光成鏡面，電化學(xué)活化預(yù)處理及超聲清洗潔凈后作為工作電極，SCE為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，將該三電極體系浸入濃度為0.01mol/L的L-半胱氨酸的PBS緩沖溶液(pH=6.864)中，采用循環(huán)伏安法在 -0.8～0.6 V電位范圍內(nèi)，以100mV/s的掃速重復(fù)循環(huán)掃描10周，即可制得L-Cys/GC電極.

1.3 分析測(cè)試方法

采用循環(huán)伏安法在50mL容量瓶中加入一定量的DA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH為6.864的PBS稀釋至刻度，搖勻，倒入電解池中.采用傳統(tǒng)三電極體系:L-Cys/GC電極為工作電極，SCE為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，放置于DA溶液中，開路攪拌富集20 s后，在-0.2～0.6 V電位掃描范圍內(nèi)以100mV/s的掃描速率掃描，記錄循環(huán)伏安曲線，測(cè)量電流-電位圖上氧化還原峰的峰電流.每次掃描結(jié)束后，將電極置于空白底液中循環(huán)掃描至無峰，濾紙吸干后，即可再生.

2 結(jié)果與討論

2.1 L-Cys在玻碳電極上的修飾

實(shí)驗(yàn)考查了不同修飾劑濃度、pH、掃描速率及電位范圍對(duì)DA的電催化作用的影響.結(jié)果表明:當(dāng)修飾底液 pH 為 6.684、L-Cys濃度為0.01mol/L、電位范圍為 -0.8 ～0.6 V、掃描速率為100mV/s時(shí)，隨著掃描周數(shù)的增加，DA的氧化峰和還原峰的峰電流都同時(shí)逐漸增加.這充分說明L-Cys逐漸被修飾到玻碳電極表面形成了一層薄膜，因而才會(huì)對(duì)DA產(chǎn)生明顯的電催化作用，并且其電催化作用也越來越強(qiáng).掃描次數(shù)為10周時(shí)，所得修飾電極最佳.

2.2 DA在L-Cys/GC電極上的電化學(xué)行為

圖1為3.0×10-4mol/L DA 在 PBS(pH=6.684)中，在L-Cys/GC電極(a)和裸GC電極(b)上的CV曲線.圖1表明，在b電極上，DA出現(xiàn)了一對(duì)極其微弱的類似于“饅頭”的氧化還原峰，峰電流很低;而在a電極上，則出現(xiàn)了一對(duì)明顯的氧化峰和還原峰，峰電流比值略大于1，峰電位分別約為 Epa=0.180 V、Epc=0.125 V，峰電位差△E=55mV.根據(jù)可逆體系中△E=Epa-Epc=0.059 V/n可得，DA在電極表面發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移數(shù)目n為1，與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的結(jié)果一致.這就說明了L-Cys薄膜加速了DA在玻碳電極表面電子轉(zhuǎn)移的速率，從而起到對(duì)DA優(yōu)良的電化學(xué)催化作用，即是L-Cys膜對(duì)DA的電化學(xué)反應(yīng)起到了明顯的促進(jìn)作用，比其在裸GC電極上更容易發(fā)生電化學(xué)反應(yīng).

圖1 DA在L-Cys/GC電極和裸GC電極上的循環(huán)伏安曲線

2.3 電化學(xué)測(cè)試條件的選擇與優(yōu)化

2.3.1 緩沖體系的選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了鄰苯二甲酸氫鉀、NaAc-HAc、混合磷酸鹽、四硼酸鈉等緩沖體系.結(jié)果顯示，在混合磷酸鹽緩沖體系中，DA在修飾電極上的峰形最好，峰電流穩(wěn)定，且電極重現(xiàn)性也很好.因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.1mol/L PBS體系作為緩沖介質(zhì).

2.3.2 pH值的選擇

考察了修飾玻碳電極在pH為4.0～9.0的磷酸鹽緩沖溶液體系中的影響.結(jié)果如圖2所示，當(dāng)pH為6.864時(shí)，峰電流達(dá)到最大值.同時(shí)，就DA的氧化反應(yīng)過程而言，電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的效果明顯優(yōu)于還原反應(yīng)過程.故實(shí)驗(yàn)選用pH為6.864的PBS緩沖溶液作為測(cè)試介質(zhì)的最佳pH值.

圖2 DA的氧化峰峰電流與pH值的關(guān)系

2.3.3 富集時(shí)間的選擇

含有5×10-4mol/L的 DA在 pH=6.864的PBS緩沖溶液體系中，分別攪拌富集1、5、10、20、30 s的修飾電極作為工作電極，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在-0.3～0.6 V電位范圍，隨著富集時(shí)間的增加峰電流也在逐漸增大，但20 s以后，峰電流趨于穩(wěn)定，在20 s所得循環(huán)伏安曲線峰型最好、峰電流最大.故實(shí)驗(yàn)選擇富集時(shí)間為20 s.

2.4 實(shí)驗(yàn)測(cè)定線性范圍和檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)于DA的氧化過程，測(cè)定得出DA的氧化峰電流(Ipa)與其濃度在1×10-3～1.0×10-6mol/L范圍呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，如圖3所示，其線性回歸方程Ipa(μA)=-9.80379 logC(DA)+59.40981，相關(guān)系數(shù) R2=0.99231.最低檢出限可低至 1.0 ×10-7mol/L(S/N=3).

圖3 陽極氧化峰電流與DA濃度的關(guān)系

2.5 電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

實(shí)驗(yàn)中，將優(yōu)化條件下制得的修飾電極每次用于DA的測(cè)定后，保存在pH=6.864的PBS緩沖溶液中再用于對(duì)DA的測(cè)定，響應(yīng)信號(hào)仍然保持在98.5%以上，說明該方法制得的L-Cys/GC電極具有良好的穩(wěn)定性.用此修飾電極對(duì)1×10-4mol/L的多巴胺重復(fù)測(cè)定50次，峰電流基本保持不變，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為2.5%，表明此電極用于DA的測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性.

3 結(jié)論與展望

在實(shí)驗(yàn)中，采用循環(huán)伏安法制備了L-Cys/GC電極，研究了DA在L-Cys/GC電極上的電化學(xué)行為，并利用該電極對(duì)微量DA進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果表明，L-Cys/GC電極表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，測(cè)定DA的靈敏度高，線性范圍寬，檢出限低，可望將其進(jìn)一步微型化發(fā)展為超微電極或微電極，應(yīng)用于實(shí)際樣品或者生物活體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)DA的測(cè)定及相關(guān)研究.

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