彭正午薛芬席敏王化寧喬昱婷譚慶榮

·論 著·

帕羅西汀對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用及其機制研究☆

彭正午*薛芬*席敏*王化寧*喬昱婷*譚慶榮*

目的 探討帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增殖的作用及其相關(guān)機制。方法 原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機分為4個研究組和對照組（sham組）。研究組細(xì)胞分別直接給予終濃度為5、10、20和50 μmoL／L劑量的帕羅西汀，處理24或48 h。采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測星型膠質(zhì)細(xì)胞活性，免疫細(xì)胞化學(xué)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）檢測細(xì)胞增殖情況，蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylatged extracellular single-regulated kinase，pERK1／2）的表達(dá)水平。結(jié)果48 h后各組的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力、BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量以及pERK1／2的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較，10 μmoL／L帕羅西汀組的上述3個指標(biāo)均高于其他劑量組和對照組（P＜0.01）；而50 μmoL／L帕羅西汀組細(xì)胞活力均低于其他組（P＜0.01）。5、10和20 μmoL／L帕羅西汀組作用24或48 h后，細(xì)胞活力、BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量以及pERK1／2的表達(dá)與對照組之間無差異（P＞0.05）。結(jié)論 帕羅西汀能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性和增殖，而且這種作用可能與ERK信號通路有關(guān)。

帕羅西汀 星形膠質(zhì)細(xì)胞 增殖作用

既往認(rèn)為選擇性5-羥色胺回收抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）的作用機制主要是通過抑制突觸前膜對突觸間隙5-HT的再攝取來提高突觸間隙 5-HT的濃度［1］，從而改善抑郁癥狀。但近年，有研究顯示抑郁癥患者海馬體積萎縮［2－3］，而抗抑郁藥治療可以部分緩解這些現(xiàn)象［4］，并可以促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生［5－6］，提示對海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)作用可能是抗抑郁藥物的作用機制之一［7］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥模型大鼠海馬還存在星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，而給予SSRI類的氟西汀干預(yù)后可抑制其凋亡［8］，提示對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用也可能是抗抑郁藥作用的靶點之一。本研究通過觀察另一種SSRI類抗抑郁藥－帕羅西汀對離體海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylatged extracellular single-regulated kinase，pERK1／2）的表達(dá)的變化，探討帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及其相關(guān)機制，進(jìn)而為探討SSRI類抗抑郁藥作用的可能機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，取出新生SD大鼠的海馬組織，機械剪碎并吹散，過200目篩網(wǎng)，將細(xì)胞接種于由多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)14 d后在37℃恒溫?fù)u床250 r／min條件下震搖過夜，棄去培養(yǎng)基，以分離得到純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞。純化后的星型膠質(zhì)細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。帕羅西汀 （Sigma）用DMSO溶解后，用DMEM培養(yǎng)基將其稀釋為不同濃度，并使培養(yǎng)基中DMSO的終濃度為0.1%。對照組為含0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定 純化后的星型膠質(zhì)細(xì)胞，以2×104個／孔接種于多聚賴氨酸包被的24孔板中。接種2 h后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以鑒定其純度。以4%多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，經(jīng)1%的BSA（犢牛血清白蛋白）封閉30 min后，孵育一抗過夜（mouse anti-GFAP，Millipore，1∶400）。經(jīng)PBS漂洗，孵育二抗2 h（Alexa Fluor 594 donkey antimouse IgG，Invitrogen，1∶1000），并用DAPI（Roche）染細(xì)胞核，經(jīng)漂洗后，50%甘油封片，并在FV-1000型激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS）下觀察并照相。計算神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）陽性細(xì)胞在所有細(xì)胞中占有的比例。

1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞活性測試 星形膠質(zhì)細(xì)胞以5 ×104個／mL接種于96孔板，每孔100 μL。在其上清液中添加不同濃度的帕羅西汀 （每組重復(fù)6孔），作用24 h或48 h后檢測細(xì)胞活力，以檢測帕羅西汀直接作用后，對其細(xì)胞活力的影響。處理結(jié)束后，每孔再加入2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（cck-8，碧云天）溶液10 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用 Dynatech MR4000型酶聯(lián)免疫讀數(shù)儀檢測其OD值，實驗波長450 nm。

1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 星型膠質(zhì)細(xì)胞以2×104個／孔接種于多聚賴氨酸包被的24孔板中。在其培養(yǎng)基中添加5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）（Sigma，終濃度10 μmoL／L）及帕羅西汀，每組重復(fù)5孔。作用48 h后，經(jīng)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。以4%多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，2N的HCl在37℃作用30 min后，以0.1 mol／L的硼酸緩沖液（pH 8.5）作用10 min，經(jīng)1%的BSA封閉30 min后，孵育一抗過夜 （rabbit anti-GFAP，Millipore， 1∶400；mouse anti-BrdU，Sigma，1∶500）。經(jīng)PBS漂洗，孵育二抗2 h（Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG，Invitrogen，1∶1000；Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG，Invitrogen，1∶500），經(jīng)漂洗后，50%甘油封片，并在FV-1000型激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.5 Western blot檢測pERK1／2表達(dá)水平 帕羅西汀作用48 h后，細(xì)胞經(jīng)蛋白質(zhì)抽取試劑（1 mL RIPA抽提試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑混合液和5 μL PMSF）提取蛋白質(zhì)，經(jīng)變性后，按BCA蛋白定量結(jié)果，取總蛋白為40 μg的樣品經(jīng)10%SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺）電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜；以封閉液（25 mmoL／L TBS溶液，5 g／L脫脂奶粉，1 ml／L吐溫-20）室溫封閉1 h。加入相應(yīng)抗體4℃孵育過夜（rabbit anti-pERK1／2，Cell Signalling，1∶2500；mouse anti-β-actin，Sigma，1∶6000），洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)化學(xué)熒光試劑顯影（Millipore），在暗室中用X光膠片壓片成像。掃描各免疫印跡條帶并進(jìn)行分析。

1.6 圖像半定量分析 每張細(xì)胞爬片在20或40倍物鏡下取8個視野，用圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）分析計算圖片中陽性細(xì)胞數(shù)量，求平均值。掃描的Western blot底片用Image J分析條帶的陽性產(chǎn)物面積，計算陽性產(chǎn)物與β-actin面積比。

1.7 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組之間的比較用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布并經(jīng)方差齊性檢驗后，兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定 原代培養(yǎng)的星形

膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞染色后，其純度在95%以上，可以用于實驗。鑒定圖片見圖1。

2.2 帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的作用 帕羅西汀直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后5 μmoL組、10 μmoL組、20 μmoL組與sham組吸光度分別為（0.54±0.05）、（0.53±0.08）、（0.49±0.01）、（0.011± 0.01）、（0.56±0.02），各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝86.895，P＜0.001），兩兩比較顯示，僅50 μM組吸光度低于其他各組（P＜0.01）。

帕羅西汀直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h后，5 μmoL組、10 μmoL組、20 μmoL組與sham組吸光度依次為 （0.56±0.05）、（0.65±0.01）、（0.52± 0.02）、（0.10±0.01）和（0.54±0.03），差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝294.33，P＜0.001），其中10 μmoL組吸光度顯著高于sham組 （P＜0.01），50 μmoL組吸光度顯著低于其他處理組（P＜0.001）。

2.3 帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用 帕羅西汀直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h后， 5 μmoL組、10 μmoL組、20 μmoL組與sham組BrdU＋細(xì)胞數(shù)量分別為（69.21±6.22）、（99.40±10.01）、（66.80 ±7.46）和（71.20±9.36），各組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝15.446，P＜0.001），其中10 μmoL組顯著高于其他處理組（P＜0.01）。

2.4 帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞pERK1／2表達(dá)的影響 帕羅西汀直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h后，5 μmoL組、10μmoL組、20μmoL組與sham組pERK1／2表達(dá)水平（與β-actin比對）分別為（0.84±0.10）、（1.24 ±0.04）、（0.75±0.08）和（0.91±0.17），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝14.10，P＜0.001），其中10μmoL組顯著高于其他處理組（P＜0.01）。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元有支持、營養(yǎng)的作用，而且對突觸功能活動的調(diào)節(jié)具有重要作用［9］。而星形膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥的病理生理中可能發(fā)生了一定作用［10］。研究表明，抑郁癥患者大腦邊緣系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度和功能顯著下降［11］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，星型膠質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)功能性的 5-HT受體［12］，抗抑郁藥物能夠直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞上的5-HT受體，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細(xì)胞鈣信號，起到抑制其凋亡的作用［13］。還有研究發(fā)現(xiàn)SSRI類抗抑郁藥能通過快速上調(diào)ERK水平，增加膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）的表達(dá)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［14］。因此，抗抑郁藥可能通過作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞并通過ERK通路來發(fā)揮其生物學(xué)功能，但需要進(jìn)一步證實。

圖1 星型膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定

圖2 不同劑量帕羅西汀作用48 h后星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和BrdU染色情況。Bar＝200 μm

本研究結(jié)果顯示，中等濃度（10 μmoL）帕羅西汀不僅能促進(jìn)體外培養(yǎng)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力，而且還能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。這與氟西汀對在體抑郁動物模型作用的研究結(jié)果相一致［15］：長期給予氟西汀處理，不僅能夠促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生，而且還能促進(jìn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞S100beta的表達(dá)。上述研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是SSRI類抗抑郁藥物作用的靶點之一。同時，本研究結(jié)果也進(jìn)一步顯示，中等劑量的帕羅西汀能夠促進(jìn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞pERK1／2的表達(dá)。既往的在體研究發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠海馬pERK1／2的表達(dá)降低，而長期給予帕羅西汀能夠上調(diào)ERK和CREB磷酸化水平［16］，提示帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用可能與ERK信號通路的活性有關(guān)。

圖3 帕羅西汀作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h后各組pERK1／2的表達(dá)。**：與其他任一處理組比較，經(jīng)LSD檢驗，P＜0.01

本研究還觀察到高濃度（50 μmoL）帕羅西汀抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞活力，而且具有毒性作用（結(jié)果未提供）。因此并沒有進(jìn)一步觀察該濃度條件下的增殖情況和pERK1／2的表達(dá)情況。這一結(jié)果提示臨床使用大劑量的帕羅西汀可能會造成星型膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，而且高劑量帕羅西汀誘發(fā)的藥物副反應(yīng)也可能與此有關(guān)。

總體而言，本研究結(jié)果表明，帕羅西汀對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，其作用機制可能與ERK信號通路的激活有關(guān)，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞可以作為一種研究抗抑郁藥物作用機制的細(xì)胞模型。要進(jìn)一步闡述星形膠質(zhì)細(xì)胞在帕羅西汀治療和產(chǎn)生副反應(yīng)過程中的作用，以及帕羅西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用機制，還需要進(jìn)一步觀察ERK信號通路抑制劑的作用，并在在體動物實驗中加以研究。

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The effect of paroxetine on the proliferation of the hippocampus-derived astrocytes.

PENG Zhengwu，XUEFen，Xi Min，WANG Huaning，Qiao Yuting，TAN Qingrong.Department of Psychosomatic Medicine，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi’an 710032.China.Tel：029－84771141.

Objective To investigate the effect of paroxetine on the proliferation of hippocampus-derived astrocytes，and explore its potential molecular mechanism.Methods Astrocytes were isolated from the hippocampus of fetal rats and were treated with different concentrations of paroxetine.The cells viability，BrdU labeling and detection and the level of phosphorylatged extracellular single-regulated kinase（pERK1／2）were measured by using the kit of CCK-8，immunocytochemical method and western blot，respectively.Results The cell viability，number of BrdU＋cells and expression of pERK1／2 in 10 μmoL／L paroxetine treated groups were significantly increased compared to the control and other groups 48 h after treatment.However，there were no significant differences in the cell viability，number of BrdU＋cells and expression of pERK1／2 among paroxetine 5 μmoL／L， 20 μmoL／L treated groups and control.Moreover，the cell viability was significantly decreased in 50 μmoL／L group.Conclusions Paroxetine can enhance the proliferation of the hippocampus-derived astrocytes via the ERK pathway.

Paroxetine Hippocampus Astrocytes Proliferation

R749.3

A

2011－05－06）

（責(zé)任編輯：曹莉萍）

☆ 國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：30870886）

* 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心身科（西安 710032）

（Email：tanqingr＠fmmu.edu.cn）