李元 戴志萍 隋毓秀

近年來抑郁癥海馬神經(jīng)重塑障礙的發(fā)病假說頗受關(guān)注，認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生發(fā)展伴隨著海馬神經(jīng)重塑功能的障礙，而抗抑郁劑的起效與其逆轉(zhuǎn)神經(jīng)再生有關(guān)［1］，但其中涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不明了。Notch信號(hào)通路在成年期動(dòng)物海馬區(qū)持續(xù)表達(dá)，且發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)重塑的作用。癲癇、腦缺血等疾病狀態(tài)下，Notch信號(hào)系統(tǒng)可以通過調(diào)整自身的功能狀態(tài)，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，對(duì)成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生有重要作用［2］。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)慢性氟西汀干預(yù)明顯促進(jìn)正常大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)再生，同時(shí)伴隨Notch1信號(hào)通路功能的增強(qiáng)［3］。上述研究提示Notch1信號(hào)系統(tǒng)可能在抑郁癥海馬神經(jīng)重塑障礙中也發(fā)揮了作用。但國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報(bào)道。故本研究擬以慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激刺激 （chronic unpredictable mild stress，CUMS）和孤養(yǎng)法建立抑郁模型，探討Notch1信號(hào)系統(tǒng)是否參與了抑郁癥神經(jīng)重塑障礙。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠，體重在220～280 g之間。選擇評(píng)分相近大鼠約54只，每組18只，隨機(jī)分為 3組：CUMS14d組、CUMS28d組和對(duì)照組。前兩組按下述方法建立抑郁模型，而對(duì)照組大鼠置于另一房間，每籠5只，不接受任何刺激。

1.2 抑郁模型的建立 聯(lián)合應(yīng)用慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激和孤養(yǎng)法建立抑郁模型。慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激刺激（CUMS）按 Banasr［4］方法略改進(jìn)，具體包括：夾尾、傾斜鼠籠、濕墊、電擊足底、冰水游泳、光照（晝夜顛倒）、禁水、行為限制。CUMS 14 d組和CUMS 28 d組分別接受14 d和28 d的隨機(jī)刺激。每日采用一種刺激，同種刺激不能持續(xù)出現(xiàn)，且單籠飼養(yǎng)。

1.3 海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活和分化 采用免疫組化和免疫熒光法分別檢測海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。其中觀察應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的大鼠，在應(yīng)激最后1 d腹腔連續(xù)注射BrdU；觀察應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活和分化影響的大鼠，在應(yīng)激開始前腹腔注射BrdU。BrdU注射后2 h，戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠。多聚甲醛磷酸緩沖液（PBS）溶液灌注、固定、取腦，海馬連續(xù)冰凍切片，片厚30 μm。BrdU免疫組化標(biāo)記物：小鼠抗大鼠BrdU抗體（1∶500），生物素化的羊抗小鼠IgG（1∶500），辣根過氧化物酶復(fù)合物（1∶100），DAB 顯色劑呈色，封片、鏡檢。BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo)標(biāo)記物：小鼠抗大鼠 BrdU抗體（1∶200），山羊抗小鼠 TRITC（1∶200），兔抗 NeuN 抗體（1∶200）或兔抗 GFAP 抗體（1∶200），山羊抗兔 FITC （1∶200）。

用Nikon CFM-500 E倒置熒光顯微鏡和圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察與分析。采用盲法立體計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)海馬齒狀回的BrdU陽性細(xì)胞總數(shù)。每只大鼠每隔6張選取1張腦片，對(duì)海馬齒狀回，計(jì)數(shù)兩條顆粒細(xì)胞層的內(nèi)側(cè)邊界和門區(qū)的BrdU陽性細(xì)胞。在400倍和1000倍的光鏡下計(jì)數(shù)，視野最邊界的細(xì)胞不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。計(jì)數(shù)每張腦切片BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，相加后乘以6即得到每個(gè)大鼠海馬齒狀回的總BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目（n＝6）。免疫熒光：每只大鼠統(tǒng)計(jì)不少于50個(gè)BrdU陽性細(xì)胞，以雙標(biāo)陽性占全部BrdU細(xì)胞的比例×100來表示（n＝6）。

1.4 Notch1信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白水平采用Real time PCR和Western blot法。應(yīng)激結(jié)束后第二天斷頭處死大鼠，快速剝離海馬，機(jī)械勻漿后置于-80℃中保存?zhèn)溆?。用Triziol法提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建聚合酶體系（Premier 5.0設(shè)計(jì)）及檢測方法詳見參考文獻(xiàn)［3］。海馬組織經(jīng)蛋白質(zhì)抽提試劑提取蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。4℃封閉過夜，用一抗（rabbit anti-NICD，Hes1，Hes5，Jag1 and Beta-actin antibody，1∶1000，Santa Cruz）室溫孵育 1h，洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（（anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase，HRP，1∶5000，Santa Cruz）。ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法）顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能儀器有限公司）進(jìn)行掃描并記錄光密度強(qiáng)度。蛋白水平結(jié)果以相對(duì)灰度值表示，即目的基因與內(nèi)參（β-actin）灰度測量比值（n＝6）。

圖1 慢性應(yīng)激對(duì)大鼠糖水偏好、曠野水平與垂直得分、強(qiáng)迫游泳漂浮不動(dòng)時(shí)間的影響（n＝6）。與對(duì)照組比較，經(jīng)方差分析，**P＜ 0.01，***P ＜ 0.001。Sucrose preference：糖水偏好；Number of squares crosted：曠野試驗(yàn)水平得分；Number of groming and rearing：曠野試驗(yàn)垂直得分；Immobolity time：漂浮不動(dòng)時(shí)間

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.5處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以±s表示。所有指標(biāo)進(jìn)行one-way-ANOVA分析，組間比較用Bonferroni法。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)估 應(yīng)激前，各組大鼠體重、糖水偏好、曠野試驗(yàn)水平與垂直得分、強(qiáng)迫游泳漂浮不動(dòng)時(shí)間無明顯差異 （P＞0.05）。應(yīng)激 14 d時(shí)，CUMS14d組、CUMS 28d組和對(duì)照組的體重增長幅度、糖水偏好、曠野試驗(yàn)水平與垂直得分及大鼠漂浮不動(dòng)時(shí)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F值分別為 5.22、24.60、6.08、23.45、48.78，P 均小于 0.05），其中兩個(gè)模型組大鼠的前面4個(gè)指標(biāo)均較對(duì)照組降低（P ＜ 0.05），而漂浮不動(dòng)時(shí)間增加（P ＜ 0.05）。應(yīng)激28 d時(shí)，與對(duì)照組相比，CUMS 28 d組大鼠的體重增長幅度、糖水偏好、曠野試驗(yàn)水平與垂直得分也明顯降低（F值分別為4.39、42.86、32.16、22.18，P 均小于 0.05），大鼠漂浮不動(dòng)時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝185.84，P ＜ 0.05）。見圖 1。

2.2 慢性應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活和分化的影響 圖2顯示CUMS對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響，BrdU陽性細(xì)胞主要位于亞顆粒細(xì)胞層（SGZ），呈簇狀，形狀不一，提示正在進(jìn)行有絲分裂的不成熟細(xì)胞［5］。CUMS14d 組、CUMS28d 組與對(duì)照組海馬BrdU陽性細(xì)胞分別為（2254.17±164.41）、（1900.33±104.10）、（2919.50±188.80），3 組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F＝65.50，P ＜ 0.001）；前兩組均較對(duì)照組明顯減少（P＜0.001）。

圖3顯示CUMS對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活的影響，BrdU陽性細(xì)胞形狀較為規(guī)整，呈圓形或橢圓形，BrdU沾染均一，單個(gè)分布在齒狀回區(qū)域。與對(duì)照組相比，CUMS 28 d組BrdU陽性細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2404.50±148.77） vs（1845.33±126.88），F(xiàn)＝49.83，P ＜ 0.001）。

免疫熒光雙標(biāo)顯示，與對(duì)照組相比，CUMS 28 d組 NeuN/BrdU 比例無明顯差異［（71.63±10.21） vs（69.11±11.30） P ＞ 0.05］；與對(duì)照組相比，CUMS 28 d組 GFAP/BrdU 比例無明顯差異［14.34±2.03）） vs（17.27±2.93），F(xiàn)＝2.61，P ＞ 0.05］。見圖 4。

2.3 慢性應(yīng)激對(duì)Notch1信號(hào)系統(tǒng)各因子基因表達(dá)和蛋白水平的影響 CUMS14d組、CUMS28d組和對(duì)照組3組的Notch1信號(hào)通路各因子NICDmRNA、Hes1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1mRNA 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F 值分別為 151.57、165.13、21.26、156.01，P 均小于 0.01），前兩組均較對(duì)照組明顯減少（P ＜ 0.01）。見表1。

如表2所示，CUMS14d組、CUMS28d組和對(duì)照組 3組的 Notch1信號(hào)通路各因子 NICD、Hes1、Hes5、Jagged1的蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為 96.59、28.65、5.99、67.56，P 均小于 0.01），前兩組均較對(duì)照組明顯減少（P＜0.01）。

圖2 慢性應(yīng)激對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響（n＝6）。A、B、C分別顯示對(duì)照組、CUMS 14 d組和CUMS 28 d組海馬BrdU陽性細(xì)胞（10×），右下角所示為圖中箭頭所指的呈簇狀的BrdU陽性細(xì)胞在高倍鏡下的圖片（40 × ）。SGZ：亞顆粒層，GCL：顆粒層，Hilus：門區(qū)，下圖同。

圖3 慢性應(yīng)激對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞存活的影響（n＝6）。A、B分別顯示經(jīng)過28 d應(yīng)激后對(duì)照組、CUMS 28 d組海馬的存活神經(jīng)干細(xì)胞（10×）。

圖4 海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的分化（BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo)）（20× ）（n＝6）

表1 慢性應(yīng)激后各組大鼠Notch1信號(hào)通路各因子基因表達(dá)與對(duì)照組的比較

表2 慢性應(yīng)激后各組大鼠Notch1信號(hào)通路各因子蛋白水平與對(duì)照組的比較

3 討論

本研究以CUMS方法建立抑郁癥模型，可比較真實(shí)、客觀的在大鼠身上模擬人類的抑郁癥狀［6］。本研究結(jié)果顯示，持續(xù)14天和28天的慢性溫和不可預(yù)知的應(yīng)激和孤養(yǎng)法均可以抑制大鼠體重的增長幅度，大鼠糖水偏好度顯著降低，大鼠的總走格次數(shù)和直立活動(dòng)均降低，強(qiáng)迫游泳漂浮不動(dòng)時(shí)間均顯著增加，反映出應(yīng)激后大鼠的快感缺乏，活動(dòng)度和對(duì)新異環(huán)境探究度降低，符合動(dòng)物抑郁癥狀的行動(dòng)遲緩、被動(dòng)和懶散，及應(yīng)激導(dǎo)致的行為絕望，表明本研究成功建立了抑郁模型。本研究設(shè)定干預(yù)14 d和28 d兩個(gè)CUMS模型組，意在動(dòng)態(tài)觀察應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞再生和Notch信號(hào)的影響。

本研究結(jié)果顯示，形態(tài)學(xué)觀察顯示14 d和28 d抑郁模型組大鼠的海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖減少，且海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活也較對(duì)照組明顯減少，表明抑郁大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活受到抑制；對(duì)照組與 CUMS組 NeuN/BrdU、GFAP/BrdU 無明顯差異，說明應(yīng)激對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞無明顯影響。這與目前大部分研究結(jié)果一致［7］。既往研究結(jié)果顯示，抑郁狀態(tài)下大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖減少［8］；CUMS造摸能夠較好地模擬抑郁癥狀，并影響海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生包括增殖、分化和存活［9］。本研究對(duì)海馬干細(xì)胞分化的結(jié)果進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞中約70%為NeuN/BrdU陽性細(xì)胞，15%為 GFAP/BrdU陽性細(xì)胞，15%的BrdU陽性細(xì)胞未雙標(biāo)?？赡苁歉杉?xì)胞分化的另一亞型細(xì)胞，或是位于組織深部，抗體達(dá)不到，或是尚未分化的細(xì)胞［9］。綜上所述，慢性應(yīng)激干預(yù)的大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活受到抑制，而對(duì)分化無明顯影響，進(jìn)一步在動(dòng)物模型中驗(yàn)證了抑郁癥神經(jīng)重塑障礙假說，表明神經(jīng)再生在抑郁癥的發(fā)生中扮演重要角色。

Notch通路由 Notch受體、Notch配體 Jag1及DNA結(jié)合蛋白-CSL組成。Hes 1、Hes 5為Notch通路激活后的靶基因，NICD是Notch信號(hào)系統(tǒng)的胞內(nèi)活性部分，我們選取NICD、Hes1、Hes5和Jag1作為檢測指標(biāo)，可以較為全面的反映Notch通路的功能狀態(tài)。結(jié)果顯示，Notch1mRNA、Hes1mRNA、Hes5mRNA表達(dá)在慢性應(yīng)激14 d和28 d后均顯著減少；Notch1、Hes1、Hes5蛋白水平在慢性應(yīng)激 14 d和28 d后亦顯著減少。Notch通路基因和蛋白水平的下降，提示應(yīng)激導(dǎo)致Notch信號(hào)系統(tǒng)功能的下調(diào)，且與慢性應(yīng)激降低大鼠神經(jīng)發(fā)生并行存在。既往研究表明，Notch信號(hào)通路在成年期維持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新中起到重要作用［10］。其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用的bHLH基因有抑制型和促進(jìn)型兩類，前者包括HES-1、HES-3和HES-5，后者包括神經(jīng)分化發(fā)育相關(guān)基因Mash-1、Math、原神經(jīng)基因Ngn。當(dāng)抑制型bHLH基因表達(dá)時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞的分化被抑制。通過上調(diào)HES-1和HES-5基因的表達(dá)，抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，從而保持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合適的數(shù)目和比例。當(dāng)促進(jìn)型bHLH基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，不僅可以促使神經(jīng)元的生成，而且可以誘導(dǎo)Notch配體的表達(dá)，這些配體可以活化鄰近細(xì)胞的Notch信號(hào)通路，上調(diào)其HES-1、HES-3和 HES-5的表達(dá)。從而保持其在未分化狀態(tài)，從而維持神經(jīng)干細(xì)胞的穩(wěn)定和增殖［11］。因此，應(yīng)激干預(yù)下Notch信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，提示Notch1信號(hào)通路有可能與慢性應(yīng)激狀態(tài)下海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活的調(diào)節(jié)有關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，Notch配體（Jag1）的mRNA表達(dá)和Jag1蛋白水平在慢性應(yīng)激14 d和28 d后均顯著下降。研究表明，Jag1可通過作用于Notch受體和其下游效應(yīng)器信號(hào)分子Shh等來促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生存［12］。Jagl可誘導(dǎo)Shh蛋白的長期表達(dá)，海馬齒狀回的Shh過分表達(dá)增加海馬亞顆粒區(qū)細(xì)胞的增殖和神經(jīng)發(fā)生［13］。在體外，Shh還可以增加室下區(qū)細(xì)胞的增殖。因此，本研究中Jag1表達(dá)的降低與Notch信號(hào)功能下調(diào)是一致的，這與其減少神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活的作用有關(guān)。

我們前期在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟西汀促進(jìn)正常大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞再生的同時(shí)Notch信號(hào)功能上調(diào)［3］，離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)系統(tǒng)可能參與氟西汀上調(diào)胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖［14］。盡管如此，目前的研究結(jié)果尚不足以證實(shí)Notch信號(hào)通路參與抑郁大鼠海馬神經(jīng)重塑的調(diào)節(jié)，理想的實(shí)驗(yàn)是采用拮抗Notch信號(hào)的激活，觀察有無神經(jīng)再生和抑郁行為的好轉(zhuǎn)。但由于γ泌肽酶抑制劑DAPT（Notch通路的常用阻斷劑）有明顯的腸道毒性，且參與體內(nèi)多個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，DAPT的應(yīng)用將造成包括癡呆樣的副反應(yīng)，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)的觀察［14］。因而，在體實(shí)驗(yàn)很難進(jìn)一步驗(yàn)證Notch信號(hào)通路在抑郁神經(jīng)重塑中的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激狀態(tài)下Notch1信號(hào)通路下調(diào)的同時(shí)，海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活受到抑制。二者發(fā)生的一致性，同時(shí)結(jié)合近年來有關(guān)Notch信號(hào)通路在成年后神經(jīng)再生作用的研究結(jié)果，初步提示Notch1信號(hào)系統(tǒng)可能與抑郁狀態(tài)下海馬神經(jīng)重塑障礙有關(guān)。下一步本研究擬以抗抑郁劑干預(yù)抑郁模型大鼠并同時(shí)觀察Notch1信號(hào)系統(tǒng)的改變以驗(yàn)證本研究假說［15］，以期為探討抑郁障礙的發(fā)病機(jī)制有所貢獻(xiàn)。

［1］Dranovsky A，Hen R.Hippocampal neurogenesis： regulation by stress and antidepressants ［J］.Biol Psychiatry，2006，59（12）：1136－1143.

［2］Nadel L.Down's syndrome： a genetic disorder in biobehavioral perspective［J］.Genes Brain Behav，2003，2（3）：156－166.

［3］Sui Y，Zhang Z，Guo Y，et al.The function of Notch1 signaling was increased in parallel with neurogenesis in rat hippocampus after chronic fluoxetine administration［J］.Biol Pharm Bull，2009，32（10）：1776－1782.

［4］Banasr M，Duman RS.Regulation of neurogenesis and gliogenesis by stress and antidepressant treatment ［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2007，6（5）：311－320.

［5］Gouirand AM，Matuszewich L.The effects of chronic unpredictable stress on male rats in the water maze ［J］.Physiology＆ Behavior，2005，86（1－2）：21－31.

［6］ 隋毓秀，張志珺，郭怡菁，等.Notch1信號(hào)系統(tǒng)在氟西汀上調(diào)大鼠海馬神經(jīng)再生中的作用［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2011，37（5）：285－289.

［7］Warner Schmidt JL，Duman RS.Hippocampal neurogenesis：opposing effects of stress and antidepressant treatment［J］.Hippocampus，2006，16（3）：239－249.

［8］Lucassen PJ，Meerlo P，Naylor AS，et al.Regulation of adult neurogenesis by stress，sleep disruption，exercise and inflammation： Implications for depression and antidepressant action［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2010，20（1）：1－17.

［9］Bain MJ，Dwyer SM，Rusak B.Restraint stress affects hippocampal cell proliferation differently in rats and mice［J］.Neurosci Lett，2004，368（1）：7－10.

［10］Yoon K，Gaiano N.Notch signaling in the mammalian central nervous system： insights from mouse mutants［J］.Nat Neurosci，2005，8（6）：709－715.

［11］Arumugam TV，Chan SL，Jo DG，et al.Gamma secretasemediated Notch signaling worsens brain damage and functional outcome in ischemic stroke［J］.Nat Med，2006，12（6）：621－623.

［12］Shimojo H，Ohtsuka T，Kageyama R.Oscillations in notch signaling regulates maintenance of neural progenitors［J］.Neuron，2008，58（1）：52－64.

［13］Breunig JJ，Silbereis J，Vaccarino FM，et al.Notch regulates cell fate and dendrite morphology of newborn neurons in the postnatal dentate gyrus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（51）：20558－20563.

［14］隋毓秀，張志珺，郭怡菁，等.氟西汀調(diào)控胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖中Notch1通路基因表達(dá)的改變［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（5）：509－513.

［15］隋毓秀，張志珺，郭怡菁，等.Notch1信號(hào)系統(tǒng)與抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)重塑障礙［J］.中華精神科雜志，2011，44：163－169.