方玲王檸林珉婷慕容慎行

·論 著·

內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因第4內(nèi)含子基因多態(tài)與福建漢族腦血管病的相關性☆

方玲*王檸*林珉婷*慕容慎行*

目的 研究福建漢族人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因第4內(nèi)含子27 bp可變串聯(lián)重復序列（variable number of tandem repeat，VNTR）與腦血管病關系。方法 依據(jù)缺血性卒中TOAST（Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment）分型收集132例大動脈粥樣硬化性卒中 （large artery atherosclerosis，LAA），63例腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）及62例高血壓性腦出血患者為病例組，同時選擇年齡、性別匹配的237名健康者為對照組，采用聚合酶鏈反應結合2%瓊脂糖電泳技術檢測eNOS基因第4號內(nèi)含子27 bp VNTR的多態(tài)性。結果 正常福建漢族人eNOS基因第4內(nèi)含子除bb，ab，aa基因型外，尚出現(xiàn)罕見的 bc基因型，其基因型頻率分別為 0.789，0.203，0.004，0.004；b、a、c等位基因頻率分別為.892，0.106及0.002。LAA及LI患者27 bp VNTR多態(tài)與對照組差別無統(tǒng)計學意義，LAA組bc基因型頻率（0.030）雖明顯高于對照組（0.004），但差異無統(tǒng)計學意義；缺血性卒中伴／不伴高血壓病與該基因多態(tài)無相關性。高血壓性腦出血患者的aa基因型頻率為0.048，明顯高于bb＋ab基因型（OR＝11.42，95%CI：1.209－117.892，P＜0.05）。結論eNOS第4內(nèi)含子aa基因型可能是福建漢族人高血壓性腦出血的遺傳危險因素，但該位點多態(tài)性與福建漢族LAA及LI無相關性。

腦血管病 內(nèi)皮型一氧化氮合酶 基因多態(tài)

腦血管病是由遺傳和環(huán)境因素疊加損害腦血管所致。高血壓?。╡ssential hypertension，EH）是腦血管病最重要和獨立的危險因素，與大動脈粥樣硬化性卒中（large artery atherosclerosis，LAA）、腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）及腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）均有密切關系。研究表明內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因第4內(nèi)含子的27 bp VNTR與EH發(fā)病相關［1－2］，并可能與缺血性卒中相關，但結果存在爭議［3－8］。我們以福建漢族人群為研究對象，探討該基因多態(tài)性與腦血管病的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 ①對照組：無親緣關系的健康體檢人員共237名（男190名，女47名），年齡（61.5 ±10.6）歲，均為福建漢族人。無卒中家族史，無肝、腎、甲狀腺病史、糖尿病及心腦血管病史；②缺血性卒中組：本院神經(jīng)內(nèi)科住院缺血性卒中患者195例，男 150例，女 45例，平均年齡（62.5± 10.9歲，均為福建漢族人，無親緣關系。符合1996年全國腦血管病診斷標準［9］，并經(jīng)頭顱 CT和（或）MRI證實。根據(jù) TOAST分型［10］，入選 LI患者63例，LAA患者132例，其中有高血壓病的LAA患者71例，排除心源性卒中、動脈炎、外傷、血液病、藥物等原因引起的腦梗死；③高血壓性腦出血組：患者62例，男50例，女12例，平均年齡（59.4±15.9）歲，高血壓病符合1997年WHO診斷標準，排除繼發(fā)性高血壓。排除腦梗死、腫瘤、血液病、動脈炎、藥物、腦血管畸形或動脈瘤等引起的繼發(fā)性腦出血。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA的提取 抽取研究對象外周靜脈血2 mL，以DNA抽提試劑盒（Amersham Phamacia公司）抽提基因組DNA。

1.2.2 合酶鏈反應（PCR）擴增－瓊脂糖凝膠電泳檢測 引物序列參照文獻［11］，上游引物：5′-AGGCC CTATGGTAGTGCCTTT-3′，下游引物：5′-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3′。PCR反應體系50 μl：基因組DNA 250 ng，dNTP各200 μmol／L，MgCl21.5 mmol／L，上下游引物各0.25 μmol／L，Taq酶2.5 U及其1×緩沖液。試劑由上海生工公司提供。擴增條件：94℃預變性2 min，93℃45 s，54℃45 s，72℃1 min，30次循環(huán)周期后72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μl與等體積加樣緩沖液混合后采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，80V電壓電泳1.5～2 h，以100 bp Marker為分子量標記，紫外燈下根據(jù)片段大小判斷基因型并拍照（圖1）。PCR擴增產(chǎn)物片段分別為393 bp（4a）、420 bp（4b）及罕見的447 bp（4c）。

1.2.3 DNA序列分析 將447 bp條帶以低熔點瓊脂糖回收并以Qiaquick Spin（Qiagen公司）過柱純化后采用 ABI PRISMTM 3730自動測序儀進行DNA序列分析（圖2）。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以Handy-Weinberg平衡評估樣本的群體代表性，組間頻率比較采用χ2檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

圖1 eNOS基因第4內(nèi)含子瓊脂糖電泳圖

圖2 eNOS基因第4內(nèi)含子c等位基因測序圖

2.1 不同種族正常人群eNOS基因第4內(nèi)含子27 bp VNTR基因型及基因頻率 福建漢族正常人群eNOS基因內(nèi)含子4有bb，ab，aa，bc四種基因型，符合Handy-Weinberg平衡。不同種族人群中bb基因型均為最常見的類型［4，12－13］，西班牙及印度人aa基因型多于中國人［4，12］；非裔美國人 c等位基因頻率高于其他種族人群，且出現(xiàn)ac基因型［13］。

2.2 缺血性卒中亞型eNOS基因27bpVNTR基因型及基因頻率 LAA組及LI組基因型均符合Handy-Weinberg平衡，與對照組相比差別無統(tǒng)計意義。在病例組檢測出bc型5例，LAA組bc基因型頻率雖高于對照組，但無統(tǒng)計學差異。

2.3 高血壓性腦出血及伴高血壓病的大動脈粥樣硬化性卒中eNOS基因27bpVNTR基因型及基因頻率 伴或不伴有高血壓病的LAA組及高血壓性腦出血組基因型均符合Handy-Weinberg平衡，伴或不伴有高血壓病的LAA組與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義。在高血壓性腦出血組，aa基因型者高于對照組（P＜0.05），與bb＋ab基因型相比，其相對危險度為11.42。

3 討論

一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L－精氨酸生成。NOS分為三型，Ⅰ型為神經(jīng)元型（neuronal nitric oxide synthase，nNOS），Ⅱ型為誘導型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS），Ⅲ型為內(nèi)皮型NOS（eNOS）。由eNOS合成的NO是最強的內(nèi)源性血管擴張因子，具有抑制血小板的粘附聚集及血管內(nèi)皮增殖的作用，NO下降可引起腦灌注量減少，腦血流自動調節(jié)功能降低，血腦屏障及血管重建功能破壞，因而與血管性疾病如高血壓病、冠心病、腦血管病、腎病以及深部靜脈血栓有關［11－13］。

eNOS基因位于人類7q35-36，含有26個外顯子，跨距約21 kb。eNOS基因4號內(nèi)含子存在27 bp VNTR，該重復序列為［GAAGTCTAGACCTGCTGC（A／G）GGGGTGAG］，重復5次者（b）第19個堿基前3次重復為A，后2次重復為G；重復4次者（a）第19個堿基前2次重復為A，后2次重復為G。重復6次者（c）第19個堿基前3次為A，后3次為G，雖然c等位基因在印度、西班牙、德國、捷克、非裔美國人中均有發(fā)現(xiàn)，但由于其很罕見，在進行統(tǒng)計學處理時常被忽略不計。我們在福建漢族人群中也檢測到該罕見片段，雖然27 bp VNTR位于內(nèi)含子區(qū)，對轉錄的調節(jié)可能并不起作用，但已有資料表明，4號內(nèi)含子的變異可能有功能或通過與功能性位點連鎖而與NO水平相關［2］，aa基因型對NO升降的影響尚有爭議［5，14－15］。

表1 不同種族人群eNOS基因4號內(nèi)含子27 bp VNTR的基因型及等位基因頻率

表2 缺血性卒中亞型eNOS基因27 bp VNTR的基因型及基因等位基因頻率

表3 高血壓性腦出血及伴高血壓病的大動脈粥樣硬化性卒中eNOS基因27 bp VNTR的基因型及等位基因頻率

不同種族人群eNOS基因27bpVNTR多態(tài)與腦血管疾病的關系有差異［4－8］。Hassan［5］及Yemisci等［6］研究認為由eNOS合成NO的減少易致穿支動脈近端小動脈硬化而引起LI，4a等位基因是LI的保護因子。葛汝麗等［8］認為a等位基因是2型糖尿病合并腦梗死的危險因素。印度一項研究［4］認為4a／b基因型與年青婦女早發(fā)卒中相關。但近來一項meta分析［3］認為4a／b基因多態(tài)與缺血性卒中無關。既往研究認為缺血性卒中TOAST分型中遺傳因素對LAA及LI影響較大［16］，因而我們主要對這兩種缺血性卒中亞型與eNOS基因多態(tài)的關系進行分析。正常福建漢族人群該位點基因型及等位基因頻率與其他種族有差別，說明不同種族人群的遺傳背景存在差異。本研究中未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與福建漢族缺血性卒中LAA及LI亞型相關。在缺血性卒中患者中bc基因型明顯高于正常人群，但在進行統(tǒng)計學處理時無顯著性差別。4c等位基因頻率在非裔美國人中較高，認為是非裔美國人缺血性卒中的遺傳標志之一［7］。因而我們認為4c等位基因與福建漢族人缺血性卒中特別是LAA可能有關，但尚需在更大樣本的人群中進行檢測。

高血壓病是腦血管病的傳統(tǒng)的獨立危險因素，與缺血性卒中的LAA及LI亞型均有密切的關系，另一方面高血壓病也是腦出血最常見及最主要的病因。同一種危險因素引發(fā)腦血管不同的病理過程與其基因型的關系尚不明確。本研究中發(fā)現(xiàn)aa基因型與高血壓性腦出血相關 （OR＝11.42），但該基因多態(tài)與高血壓伴LAA無相關性，因而認為eNOS第4內(nèi)含子aa基因型可能是福建漢族高血壓性腦出血的遺傳危險因素。aa基因型可能通過影響eNOS的表達而改變NO合成水平，從而影響腦血管收縮舒張、血小板聚集及血管平滑肌增殖。但由于國內(nèi)外對aa基因型與高血壓性腦出血關系的研究很少，其機制尚待進一步研究。

由于腦血管病的發(fā)生與年齡、吸煙、高血壓病、糖尿病等多種因素有關，不同研究結果的差異可能與種族及地區(qū)差異有關，或與取樣有關。因而對腦血管病人群進行基因多態(tài)研究時應收集大樣本根據(jù)病因及發(fā)病機制進行分型，可能會得到更準確的結果。

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Association of endothelial nitric oxide synthase gene intron 4 polymorphisms with cerebrovascular disease in Han population of Fujian.

FANG Ling，WANG Ning，LIN Minting，MURONG Shenxing.Department of Neurology，1st Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350005，China.Tel：15960090169.

Objective To investigate the association of 27 bp variable number of tandem repeat（VNTR）polymorphisms in intron 4 of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）gene with cerebrovascular disease in Han population of Fujian. Methods We characterized and studied 132 patients with large artery atherosclerosis（LAA）、63 cases with lacunar infarction（LI）according to TOAST（Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment）classification，and 62 cases with hypertensive intracerebral hemorrhage and 237 unrelated health individuals in Han population of Fujian， the 27 bp VNTR polymorphisms were detected by polymerase chain reaction and 2%agarose gel electrophoresis.Results All genotypes were in Handy-Weinberg equilibrium.Among the controls the frequencies of four genotypes bb，ba，aa，bc were 0.789，0.203，0.004，0.004，respectively，the bc genotype was rare.The allelic frequencies of b，a，and c were 0.892，0.106 and 0.002.No Significant associations of 27 bp VNTR polymorphisms with ischemic stroke were observed；although the bc genotype was overrepresented in LAA（0.030），the trend did not reach significance.The polymorphisms were not related to LAA／LI with or without hypertension.The frequency of aa genotype in hypertensive cerebral hemorrhage patients was 0.048 and significantly higher than that of bb＋aa genotype（OR＝11.42，95%CI：1.209－117.892，P＜0.05）.Conclusions In Han population of Fujian，the aa genotype may be a genetic risk factor of hypertensive intracerebral hemorrhage， but there seems no correlation between 27 bp VNTR polymorphisms and large artery atherosclerosis or lacunar infarction.

Cerebrovascular disease Endothelial nitric oxide synthase Polymorphism

R743

A

2011－05－26）

（責任編輯：李 立）

☆ 福建省自然科學基金項目（編號：2010J01151）

* 福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 （福州 350005）

（E-mail：paulinefz＠yahoo.com.cn）