王歲樓，王海翔

(中國藥科大學(xué)食品科學(xué)與安全系，江蘇 南京 210009)

利用超高壓誘變選育食品與發(fā)酵微生物的研究進(jìn)展

王歲樓，王海翔

(中國藥科大學(xué)食品科學(xué)與安全系，江蘇 南京 210009)

介紹超高壓處理對(duì)食品與發(fā)酵微生物的誘變效應(yīng)，包括其在酵母菌、細(xì)菌、霉菌等誘變選育中的應(yīng)用實(shí)例，并對(duì)超高壓誘變微生物的機(jī)理及影響因素進(jìn)行探討，最后指出超高壓作為一種新的微生物誘變育種方法將會(huì)在食品與發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

超高壓；微生物；誘變

高壓、超高壓(ultra high pressure，UHP)是一個(gè)相對(duì)的概念，一般認(rèn)為100MPa以上的壓力為超高壓，也稱為高靜水壓(high hydrostatic pressure，HHP)或靜水高壓[1]。通常認(rèn)為，超高壓對(duì)微生物的作用是破壞性的，因此在食品科學(xué)領(lǐng)域開展超高壓滅菌的研究較多。雖然對(duì)食品進(jìn)行高壓處理具有低能量輸入及保護(hù)小分子穩(wěn)定性和最大限度保持食品原有生鮮風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)勢(shì)，但由于成本較高及產(chǎn)業(yè)化困難，目前在國內(nèi)外還多處于理論或?qū)嶒?yàn)室研究階段[2]。

超高壓不僅可使微生物細(xì)胞體積形態(tài)、細(xì)胞組分發(fā)生變化，還可使微生物的基因表達(dá)和核酸結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能發(fā)生改變[3]。由于一切生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)都是核酸尤其是DNA，所以任何能改變核酸結(jié)構(gòu)的因素都可能引起核酸生物學(xué)功能的改變，而凡是能引起核酸功能改變的因素，一般也能引起突變，這是“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則的一個(gè)具體例證。然而在過去由于技術(shù)和設(shè)備所限，一直缺乏實(shí)例支持，人們認(rèn)為高壓主要是物理過程引起的菌體細(xì)胞變化[4]，例如細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞膜壁破壞、細(xì)胞內(nèi)顯微結(jié)構(gòu)變異等，很難直接發(fā)生在DNA基因水平上，一些在極端環(huán)境下生長(zhǎng)的微生物的特殊基因是經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)期(達(dá)幾萬年)的自然篩選才形成的[5]，因而認(rèn)為高壓誘變育種缺乏理論依據(jù)。但近年來已有研究表明，在高靜水壓作用下，大多數(shù)微生物不僅能夠產(chǎn)生壓力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)(PIPs)或自適應(yīng)調(diào)整細(xì)胞膜蛋白的種類和含量[6-7]，而且遺傳物質(zhì)——核酸也有可能發(fā)生改變，如高靜水壓可導(dǎo)致啤酒酵母產(chǎn)生四倍體[8]，可使酵母和大腸桿菌的DNA含量大幅度減少[9]，這些都證明高靜水壓能影響DNA的復(fù)制，預(yù)示著高壓育種技術(shù)的可行性。

1 超高壓對(duì)微生物的誘變效應(yīng)研究

國外方面，目前尚未發(fā)現(xiàn)開展超高壓誘變微生物的研究，只有從海底深處篩選到了耐高壓微生物的報(bào)道[5]。以微生物為處理對(duì)象的超高壓研究國內(nèi)外目前都有報(bào)道[10-11]，但一般以大腸桿菌和芽孢桿菌為處理對(duì)象，旨在研究食品超高壓殺菌的可行性。王歲樓等[12-16]在2001年較早提出了把超高壓用于發(fā)酵工業(yè)微生物誘變的設(shè)想，并先后對(duì)漆酶產(chǎn)生菌靈芝、雞腿菇及產(chǎn)β-胡蘿卜素紅酵母等的高壓誘變效應(yīng)作了大量實(shí)驗(yàn)研究，獲得了一些產(chǎn)量大幅度提高的可穩(wěn)定遺傳的超高壓突變株。近幾年來有關(guān)超高壓誘變微生物的報(bào)道不斷增多，例如劉鳳珠等[17]發(fā)現(xiàn)高靜壓對(duì)啤酒酵母也有誘變作用；姜岷等[18]則在200MPa壓力下篩選到了一株琥珀酸產(chǎn)量明顯提高的放線桿菌突變株。

1.1 超高壓在酵母誘變中的應(yīng)用

王歲樓等[19]利用超高壓對(duì)黏紅酵母RG5進(jìn)行處理時(shí)，獲得的突變株RG5-3，其生物量雖然比出發(fā)菌株略有下降，但目的產(chǎn)物β-胡蘿卜素的含量卻提高了68.60%，傳代實(shí)驗(yàn)表明該誘變株遺傳穩(wěn)定性良好，沒有發(fā)生性狀退化及回復(fù)突變。進(jìn)一步利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析比較發(fā)現(xiàn)，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ切割的誘變株和出發(fā)株的DNA片段有著明顯不同，初步證明了高靜水壓使黏紅酵母在表面性狀和DNA水平上都發(fā)生了改變。同時(shí)比較HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，菌株經(jīng)超高壓處理后不僅類胡蘿卜素總量明顯增產(chǎn)了，而且色素組成中β-胡蘿卜素的比例也大幅度增加了，從原來的53.34%提高到81.44%，這是非常有意義的，因?yàn)橐话阏J(rèn)為黏紅酵母β-胡蘿卜素產(chǎn)量在其總類胡蘿卜素中所占的比例偏低。

劉鳳珠等[20]采用高靜壓處理，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏啤酒酵母菌種SP-3進(jìn)行誘變處理，發(fā)現(xiàn)在250MPa，保壓時(shí)間為30min時(shí)，得到1株酵母菌株，酒精體積分?jǐn)?shù)由原來的4.7%降低到3.1%，低于出發(fā)菌珠34%，凝聚性良好，雙乙酰含量亦較低。王振偉等[21]分析了高壓處理對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)的影響，研究不同壓力、不同保壓時(shí)間對(duì)啤酒酵母致死率的影響，考察高壓與啤酒酵母變異之間的關(guān)系。確定300MPa、保壓時(shí)間為15min時(shí)，啤酒酵母具有較高的突變率，以此條件處理啤酒酵母，并以高溫篩選，獲得了耐高壓耐高溫變異菌株MS-3。

1.2 超高壓在細(xì)菌誘變中的應(yīng)用

高翔等[11]利用高壓力處理大腸桿菌TG1、DH5α和HB101，得到了耐壓的突變菌株TG1P、DH5αP和HB101P，其在220MPa高壓力下的存活率提高了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，分別從1.06×10-6、2.98×10-4、3.65×10-3提高到8.31×10-3、3.4×10-1、1.69×10-1。通過雙向電泳比較發(fā)現(xiàn)，TG1和DH5α兩種菌株耐壓突變菌的部分蛋白質(zhì)組與原始菌的有所不同，有3個(gè)蛋白質(zhì)的含量明顯增加。經(jīng)研究，其中1種蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為21kD，其N端序列為V(L)EAGEFFMRA，與大腸桿菌中的1種外膜蛋白一致。

姜岷等[18]采用超高靜壓對(duì)一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌A3進(jìn)行誘變育種，進(jìn)一步提高其生產(chǎn)性能。在壓力為200MPa、變壓速度50MPa/min的誘變條件下對(duì)穩(wěn)定期菌株進(jìn)行誘變，篩選到一株突變菌株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌B19，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到32.2g/L，比出發(fā)菌株A3提高了17.9%，代謝副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)量降低了11.5%，經(jīng)過6次傳代表明突變菌株具有穩(wěn)定的遺傳特性。

最近有人研究了高靜水壓處理對(duì)葡糖醋桿菌J2的致死率、形態(tài)、生化特征、產(chǎn)細(xì)菌纖維素能力及菌體生長(zhǎng)速率的影響[22]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高靜水壓對(duì)菌株J2的作用效果顯著。處理時(shí)間在30min內(nèi)，菌株J2的致死率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，30min時(shí)全部死亡；處理壓力在300MPa內(nèi)，菌株J2的致死率隨著壓力的增大而增大，300Pa時(shí)全部死亡。高靜水壓處理后菌株J2的形態(tài)發(fā)生了一定程度的變化，生化特性沒有發(fā)生明顯變化，但菌株對(duì)某些碳源和氮源的利用程度有明顯差異。高靜水壓處理后的菌株發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的能力明顯提高，且菌株的生長(zhǎng)速度明顯加快。

1.3 超高壓在霉菌誘變中的應(yīng)用

王華等[23]在壓力100～400MPa、保壓20min的條件下處理醬油釀造菌種——米曲霉，研究高壓對(duì)米曲霉存活率、形態(tài)特征、生理性質(zhì)、蛋白酶、淀粉酶活性等的影響，并誘變篩選優(yōu)良菌株。結(jié)果表明：高壓對(duì)米曲霉的存活率、形態(tài)特征有明顯的影響；壓力對(duì)蛋白酶及淀粉酶活性的影響也有特異的規(guī)律，即在一定壓力范圍內(nèi)(0.1～200MPa)，蛋白酶的活性隨著壓力的增加而減小，但隨著壓力的進(jìn)一步升高(200～400MPa)，蛋白酶的活性又逐漸增強(qiáng)，在300MPa時(shí)超過對(duì)照組，400MPa時(shí)蛋白酶的活性達(dá)到最高值；淀粉酶在0.1～100MPa時(shí)活性下降，在200MPa時(shí)其平均的糊化和糖化活性最強(qiáng)、活力最高，當(dāng)壓力升高活性又開始降低，400MPa時(shí)幾乎又回到對(duì)照值。另外，高壓處理后獲得一株理想的變異菌株HP300a，其生長(zhǎng)速度快、孢子數(shù)量多、蛋白酶活力高，且不易被雜菌污染。其成曲的幾項(xiàng)主要指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照株，釀出醬油的幾項(xiàng)主要指標(biāo)也明顯優(yōu)于對(duì)照株。

1.4 超高壓在其他微生物誘變中的應(yīng)用

王歲樓等[12]對(duì)漆酶產(chǎn)生菌靈芝和雞腿菇分別進(jìn)行超高壓處理，發(fā)現(xiàn)致死率隨劑量的增加而增加，在致死率為50%～80%的范圍內(nèi)誘變效果較好。實(shí)驗(yàn)獲得了兩株具有較大應(yīng)用潛力的超高壓誘變菌——靈芝高壓突變株G1502和雞腿菇高壓突變株C2003，其中G1502酶活比出發(fā)菌株提高了2.83倍，發(fā)酵時(shí)間縮短了1d；C2003酶活比原菌株提高了2.57倍，發(fā)酵時(shí)間也縮短了1d。

綜上所述，高壓能誘導(dǎo)酵母菌、細(xì)菌、霉菌等的突變，通過壓力對(duì)菌株致死率的研究發(fā)現(xiàn)：一般在250～300MPa的壓力下，菌株具有較高的突變率。獲得的突變株性能明顯優(yōu)于出發(fā)株，且遺傳穩(wěn)定性良好。這些研究成果給超高壓在菌種誘變上的應(yīng)用提供了實(shí)證，表明了超高壓在菌種誘變應(yīng)用上的可行性。

2 超高壓對(duì)微生物的誘變機(jī)理研究

2.1 超高壓誘變的理論基礎(chǔ)

超高壓誘變具有其生物化學(xué)基礎(chǔ)[3]，但目前有關(guān)微生物超高壓誘變的研究，一般都是從實(shí)用出發(fā)，研究?jī)?nèi)容多限于利用超高壓處理提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，未能從DNA分子水平上進(jìn)行變異檢測(cè)的研究。高壓法微生物育種，是一個(gè)全新的命題，若能成功，則有很突出的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值，將在國內(nèi)外遺傳學(xué)界、微生物學(xué)界、發(fā)酵與生物化工領(lǐng)域引起相當(dāng)?shù)挠绊?，甚至涉及更廣的領(lǐng)域。微生物在高壓生態(tài)條件下可以生存，這早已發(fā)現(xiàn)，但高壓條件引起微生物的遺傳突變，卻是近幾年來才有所報(bào)道。從科學(xué)的態(tài)度出發(fā)，目前既不能排除高壓引起微生物遺傳突變的可能性，但也不能過于匆忙做出高壓能促進(jìn)微生物變異的結(jié)論。也就是說，這些變異的出現(xiàn)究竟是因?yàn)樵诟邏鹤饔孟?，微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生變化導(dǎo)致突變株產(chǎn)生，還是高壓誘導(dǎo)某些基因的表達(dá)使其性狀出現(xiàn)變化？甚至有可能在群體中本來就已經(jīng)存在耐高壓且高產(chǎn)的個(gè)體，高壓處理只是起到了一種篩選的作用？因此，必須從分子水平尤其是從DNA分子水平上揭示超高壓的誘變效應(yīng)，探討其誘導(dǎo)微生物變異的機(jī)理，才能為微生物超高壓誘變育種提供理論支持，并使其成為一種可操作的技術(shù)加以普遍推廣。

2.2 從基因水平上解釋誘變效應(yīng)

李芝蓮[24]對(duì)高壓誘導(dǎo)的啤酒酵母突變株和對(duì)照株進(jìn)行PARD和ISSR分析，結(jié)果顯示對(duì)照菌株及變異菌株在RAPD和ISSR的檢測(cè)中多態(tài)性明顯，分別為84.78%和67.27%。RAPD檢測(cè)中對(duì)照菌株與變異菌株的平均絕對(duì)距離系數(shù)為0.720，ISSR檢測(cè)中對(duì)照菌株與變異菌株的平均絕對(duì)距離系數(shù)為0.583。結(jié)果表明：高壓能引起啤酒酵母產(chǎn)生可以穩(wěn)定遺傳生理上的明顯變異，且這種變異是基于DNA分子水平的變異。李黨生等[25]對(duì)高壓誘導(dǎo)的啤酒酵母突變株和出發(fā)株進(jìn)行了PARD分析，結(jié)果證實(shí)突變株經(jīng)過誘變后得到的突變株基因組堿基序列發(fā)生了改變。

王華等[23]對(duì)高壓誘導(dǎo)的米曲霉突變株和對(duì)照株進(jìn)行了PARD和ISSR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種標(biāo)記都能揭示材料間較高的多態(tài)性，其中RAPD標(biāo)記多態(tài)性又高于ISSR標(biāo)記，分別為84.44%和73.22%。RAPD檢測(cè)中對(duì)照菌株與變異菌株的平均絕對(duì)距離系數(shù)0.750，ISSR檢測(cè)中對(duì)照菌株與變異菌株的平均絕對(duì)距離系數(shù)0.553。研究結(jié)果表明高壓誘導(dǎo)的突變株DNA分子產(chǎn)生了變異。

上述研究結(jié)果表明高壓致突菌株與出發(fā)菌株的DNA分子產(chǎn)生了差異，從基因水平上闡述了變異的原因。但未對(duì)如何造成這種差異作出解釋，這也為進(jìn)一步深入探討超高壓誘變的機(jī)理帶來了困難。筆者認(rèn)為可以從下面幾點(diǎn)來進(jìn)一步深入開展工作：1)對(duì)部分RAPD產(chǎn)生的特異片段克隆測(cè)序和DNA序列分析，利用軟件分析和數(shù)據(jù)庫檢索，對(duì)特異片段DNA進(jìn)行同源性分析，判斷DNA哪些位點(diǎn)在高壓的作用下發(fā)生了變化；2)對(duì)菌株的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分析，找出差異蛋白；3)對(duì)依賴于DNA的RNA聚合酶變異進(jìn)行分析；4)對(duì)DNA位點(diǎn)的改變與性狀改變之間建立相關(guān)性分析。

3 超高壓誘變的優(yōu)勢(shì)及影響因素

3.1 超高壓誘變的優(yōu)勢(shì)

雖然采用基因工程和代謝工程技術(shù)定向改進(jìn)菌種是發(fā)展的方向，但由于該類技術(shù)本身的特點(diǎn)及操作復(fù)雜、條件要求苛刻、成本過高等原因，一般多停留在實(shí)驗(yàn)室水平或?qū)W術(shù)研究層面，如基因工程技術(shù)目前主要還只是應(yīng)用在酶和蛋白質(zhì)類產(chǎn)物(藥物)的開發(fā)研究方面，而對(duì)生產(chǎn)其他代謝產(chǎn)物的微生物菌種進(jìn)行改良的行之有效的方法仍然是誘變育種。可以說，目前具有重要工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的微生物基本上還都是人工誘變株，如利用紫外線、X-射線、γ-射線和亞硝基胍、硫酸二乙酯等對(duì)菌種進(jìn)行誘變處理，往往會(huì)獲得產(chǎn)量大幅度提高的突變株。但另一方面，這些誘變?cè)匆话愣加卸拘曰蜉椛湮廴?，而且由于反?fù)使用導(dǎo)致其誘導(dǎo)新突變的能力減弱及菌種性能容易退化。此外，近年來開始采用的離子注入、航天搭載誘變等技術(shù)，也存在成本較高、裝備復(fù)雜、操作不便或不易隨時(shí)實(shí)現(xiàn)等諸多缺點(diǎn)。

超高壓處理作為當(dāng)今高新技術(shù)之一目前已被用于食品殺菌和保鮮加工，但由于成本高和產(chǎn)業(yè)化困難，目前在國內(nèi)外還多處于理論或?qū)嶒?yàn)室研究階段，真正進(jìn)入市場(chǎng)的高壓食品還很鮮見。然而從前述可知，利用超高壓技術(shù)選育出微生物高產(chǎn)突變體已有實(shí)例，并且王歲樓等[14]相關(guān)研究表明，與傳統(tǒng)誘變育種方法相比，超高壓誘變具有高效、操作簡(jiǎn)便、無污染、無毒害、周期短、突變率和正變率較高等特點(diǎn)，可能更具應(yīng)用和推廣價(jià)值。

3.2 影響超高壓誘變的因素

影響微生物高靜水壓誘變的因素非常多、也非常復(fù)雜[3,26-32]，如壓力、溫度、作用時(shí)間、水環(huán)境、培養(yǎng)基成分、p H值、菌齡、升壓和卸壓速度等。

首先是壓力。在高靜水壓作用下，微生物細(xì)胞的受壓環(huán)境相當(dāng)重要，其中壓力的影響至為關(guān)鍵。在較低壓力條件下，細(xì)胞僅僅是被迫激活膜物質(zhì)合成基因以克服細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到的影響；而較高的壓力還誘導(dǎo)一些未知的基因和酶產(chǎn)生，這些誘導(dǎo)物主要消除高壓力所造成的更為不利的影響，如降解變性蛋白質(zhì)等。因此，在一定程度上，可以認(rèn)為高靜水壓的生物效應(yīng)就是微生物細(xì)胞對(duì)自身在該條件下的修復(fù)響應(yīng)。

其次為溫度。在研究高靜水壓對(duì)微生物的影響時(shí)，必須將其納入壓力-溫度體系進(jìn)行考察研究。壓力和溫度這兩個(gè)重要的物理參數(shù)，在某些熱力學(xué)特性上非常相似。因此，當(dāng)對(duì)壓力影響機(jī)制不太了解的情況下，可讓壓力套用溫度模型，再反過來驗(yàn)證修改壓力模型。

再次為水環(huán)境。微生物細(xì)胞必須在水環(huán)境中才能均勻地受到壓力作用，但水不只是充當(dāng)介質(zhì)和保護(hù)作用。水分子在壓力下可以滲透到天然蛋白質(zhì)分子內(nèi)部并改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使其折疊或展開，從而失去原來特有的三級(jí)結(jié)構(gòu)，成為一種特殊的中間態(tài)。這種構(gòu)象在壓力誘導(dǎo)解鏈變性的Arc阻遏子中已得到了證實(shí)[26]。

4 結(jié) 語

超高壓的生物效應(yīng)已被人們所認(rèn)識(shí)和利用，但目前主要是利用其致死效應(yīng)將超高壓用于食品殺菌和加工等領(lǐng)域，而對(duì)其誘變效應(yīng)尚未足夠重視和利用。由于高壓作用于微生物細(xì)胞，不只作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)等，還作用于核酸，所以高壓很有可能影響微生物DNA的復(fù)制并引起微生物的突變。目前已有研究表明超高壓能誘導(dǎo)微生物的突變，并且獲得了性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定性良好的突變株。雖然人們?cè)趯?shí)踐中已經(jīng)得到了突變株，但仍然需要從理論上闡述高壓誘變微生物的機(jī)理，現(xiàn)在的研究主要發(fā)現(xiàn)了突變株與出發(fā)株DNA分子上的差異，但高壓如何造成這種差異還需要進(jìn)一步研究。可以相信，隨著高壓生物科學(xué)與技術(shù)的不斷發(fā)展及對(duì)高壓誘變機(jī)理與影響因素的深入研究，超高壓作為一種新的微生物誘變育種方法，一定會(huì)在食品發(fā)酵領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Research Progress of Microbial Breeding Induced by Ultra High Pressure for Food and Fermentation Industries

WANG Sui-lou，WANG Hai-xiang
(Department of Food Science and Safety, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

This paper has introduced mutation examples of microorganisms induced by ultra high pressure (UHP), such as the mutation of yeasts, bacilli, moulds and epiphytes. The mutation mechanisms and factors for affecting microorganisms have also discussed. Finally, UHP technology as a useful method to improve breeding in food and fermentation industry in the future has also proposed.

ultra high pressure；microorganism；mutation

TS261.15

A

1002-6630(2011)03-0277-04

2011-01-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071590)

王歲樓(1961—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與食品安全。E-mail：cpuwsl@126.com