孟慶龍，潘景芝，陳 麗，王 琦,

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春市傳染病醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130123)

桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用

孟慶龍1，潘景芝2，陳 麗1，王 琦1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春市傳染病醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130123)

采用濾紙片法和二倍稀釋法對(duì)桑黃發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液的抑菌作用及熱穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：桑黃菌絲體甲醇、正丁醇提取物和發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌均有一定的抑制作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。與此同時(shí)，桑黃菌絲體正丁醇提取物對(duì)4種指示菌的抑菌率均最高，且最低抑菌質(zhì)量濃度僅為0.1563～0.3125mg/mL，從而說(shuō)明桑黃菌絲體正丁醇提取物具有較強(qiáng)的抑菌能力。

桑黃；發(fā)酵產(chǎn)物；提取物；發(fā)酵液；抑菌作用

桑黃(Phellinus igniarius (linnearus: fries) quelet)是一種多年生珍稀藥用真菌，屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、多孔菌科(Polyporaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)，又名桑臣、胡孫眼、桑黃菇[1]。主要分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家。其子實(shí)體入藥，味微苦，能利五臟、軟堅(jiān)、排毒、止血、活血等[2]。桑黃的藥用價(jià)值最早記載于李時(shí)珍《本草綱目》中，是目前國(guó)際公認(rèn)的抗癌療效最好的藥用真菌之一[3]。

近年來(lái)，由于桑黃特有的藥理活性，使其成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。桑黃除了具有傳統(tǒng)的治療淋病、崩漏、帶下、排毒和胃止瀉等功效外，還具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗肝硬化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抗誘變等藥用功能[4-8]。由于野生資源的稀少以及人工栽培難度較大，使桑黃從來(lái)源上受到了制約[9-10]。因此，應(yīng)用液體深層發(fā)酵技術(shù)已成為獲得桑黃活性成分的重要途徑之一。

目前，對(duì)桑黃的研究大多集中在抗腫瘤和提高機(jī)體免疫能力等方面[11]，而關(guān)于桑黃發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。由于合成防腐劑可能存在毒性和致癌的問(wèn)題，使得天然防腐劑的研究日趨受到人們的重視。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討桑黃發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液的抑菌活性，并通過(guò)食品加工中常見(jiàn)的熱處理操作，初步研究桑黃發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用的熱穩(wěn)定性，為桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的進(jìn)一步綜合開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

桑黃(Phellinus igniarius)子實(shí)體采自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心分離、純化菌種并保存。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellae enteritidis)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)均由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫局惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基[12]

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基以及綜合液體培養(yǎng)基。

本文調(diào)查了河北省各設(shè)區(qū)市新型城鎮(zhèn)化發(fā)展水平及信息化發(fā)展水平的變化。指標(biāo)體系中的定量指標(biāo)數(shù)據(jù)主要來(lái)源于2017年的《中國(guó)城市統(tǒng)計(jì)年鑒》《河北省經(jīng)濟(jì)年鑒》《河北省各設(shè)區(qū)市國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展公報(bào)》。

1.1.3 試劑

牛肉膏和蛋白胨為生化試劑；二甲基亞砜(20080602)上海生工生物工程有限公司；鏈霉素(20071205) 華北制藥股份有限公司；甲醇、正丁醇、石油醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

XS-213型生物顯微鏡、HG303-4K型電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京電器三廠；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；XB-K-25型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；ZHWY-111C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桑黃液體深層發(fā)酵培養(yǎng)[13]

在無(wú)菌條件下，將桑黃試管菌種菌絲接種于含有100mL綜合培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中，置于26℃、130r/min的搖床中培養(yǎng)5～7d；將三角瓶(250mL)中生長(zhǎng)較好的菌絲轉(zhuǎn)入含有400mL綜合培養(yǎng)基的三角瓶(1000mL)中，置于26℃、130r/min的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)7～10d[9]。對(duì)桑黃發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，分離菌絲體和發(fā)酵液備用。

1.2.2 桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的制備[14]

1.2.3 測(cè)試菌平板的制備[15]

將濕熱滅菌過(guò)的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)中紫外滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻后，分別用一次性無(wú)菌注射器吸取相應(yīng)量的指示菌懸液(約2.3×106CFU/mL)注入培養(yǎng)基中，并用無(wú)菌三角涂布棒將其涂布均勻后備用。

1.2.4 抑菌活性的測(cè)定[16]

在超凈工作臺(tái)中，使用三點(diǎn)接種法用鑷子分別將浸有20mg/mL桑黃發(fā)酵產(chǎn)物抑菌原液、2mg/mL鏈霉素水溶液和二甲基亞礬水溶液的濾紙片，放到測(cè)試菌平板上，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。將以上平板均倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，測(cè)量抑菌圈直徑，并求平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

抑菌率/% =(D1－D2)/D3

式中：D1為供試品抑菌圈直徑；D2為陰性對(duì)照品抑菌圈直徑；D3為陽(yáng)性對(duì)照品抑菌圈直徑。

1.2.5 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測(cè)定[17]

將桑黃發(fā)酵產(chǎn)物抑菌原液用相應(yīng)溶劑依次稀釋成20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563、0mg/mL的溶液，并倒入已溶化的40℃左右的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒板，待其冷凝后分別加入相應(yīng)量的菌懸液，涂抹均勻，37℃恒溫培養(yǎng)24h，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3次重復(fù)。觀察結(jié)果，菌落被完全抑制的最低抑菌液質(zhì)量濃度即為最低抑菌質(zhì)量濃度MIC。

1.2.6 熱穩(wěn)定性測(cè)定[18]

將桑黃發(fā)酵產(chǎn)物抑菌原液用相應(yīng)溶劑稀釋成20mg/mL的溶液，并取部分溶液分別置于40、60、80、100、121℃條件下處理30min，對(duì)照溶液置于30℃，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用抑菌圈直徑法測(cè)定處理前后樣品的抑菌活性，每個(gè)溫度設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑制作用

表1 桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑Table1 Diameters of inhibition zone of different extracts of mycelium and fermentation broth of Phellinus igniarius against the four indicator bacteria

圖1 桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑菌率Fig.1 Inhibition rate of different extracts of mycelium and fermentation broth of Phellinus igniarius against the four indicator bacteria

由表1、圖1可知，20mg/mL的桑黃菌絲體甲醇提取物(JSTJC)、正丁醇提取物(JSTZDC)、石油醚提取物(JSTSYM)、水提取物(JSTS)和發(fā)酵液(FJY)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有一定的抑制作用。其中桑黃菌絲體甲醇提取物(JSTJC)、正丁醇提取物(JSTZDC)和發(fā)酵液(FJY)對(duì)4種指示菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且廣譜抑菌效果較強(qiáng)。

2.2 桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

桑黃菌絲體甲醇提取物(JSTJC)、正丁醇提取物(JSTZDC)和發(fā)酵液(FJY)在不同質(zhì)量濃度下對(duì)4種指示菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為0.1563～0.625mg/mL。其中桑黃菌絲體正丁醇提取物(JSTZDC)對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌的最低抑菌質(zhì)量濃度均小于桑黃菌絲體甲醇提取物(JSTJC)和發(fā)酵液(FJY)，分別為0.1563、0.3125、0.1563、0.1563mg/mL，抑菌活性最強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表4 桑黃發(fā)酵液最低抑菌質(zhì)量濃度Table4 MICs of fermentation broth of Phellinus igniarius

表2 桑黃菌絲體甲醇提取物最低抑菌質(zhì)量濃度Table2 MICs of methanol extract from mycelium of Phellinus igniarius

表3 桑黃菌絲體正丁醇提取物最低抑菌質(zhì)量濃度Table3 MICs of n-butanol extract from mycelium of Phellinus igniarius

2.3 桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液抑菌活性的熱穩(wěn)定性

桑黃菌絲體甲醇提取物(JSTJC)、正丁醇提取物(JSTZDC)、石油醚提取物(JSTSYM)、水提取物(JSTS)和發(fā)酵液(FJY)對(duì)敏感型菌株金黃色葡萄球菌均具有抑制作用。如圖2所示，經(jīng)過(guò)不同溫度加熱處理后，其抑菌活性未呈現(xiàn)出較大變化，與原有的抑菌活性基本保持一致，從而表明桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖2 桑黃菌絲體不同溶劑提取物和發(fā)酵液抑菌活性的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of antibacterial activity of different extracts of mycelium and fermentation broth of Phellinus igniarius

3 討 論

長(zhǎng)久以來(lái)，從植物中尋找天然活性物質(zhì)一直是新藥研究的重要內(nèi)容，但過(guò)度采挖會(huì)造成物種的枯竭，而液體深層培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量培養(yǎng)物[19-20]。因此，通過(guò)人工發(fā)酵來(lái)獲得活性物質(zhì)無(wú)疑為新型藥物的開(kāi)發(fā)提供了新的途徑，本實(shí)驗(yàn)利用液體深層發(fā)酵技術(shù)獲得桑黃菌絲體和發(fā)酵液，為研究桑黃的藥理活性奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

到目前為止，對(duì)桑黃的研究大多集中在抗腫瘤和提高機(jī)體免疫能力方面[21-22]。而關(guān)于桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。已有研究證實(shí)，桑黃子實(shí)體的甲醇、氯仿、正丁醇和水提取物均具有抑菌活性，其正丁醇浸提取物抗耐甲氧基西林金黃色葡萄球菌效果最好，最低抑菌質(zhì)量濃度為63～125μg/mL[23]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，桑黃菌絲體不同溶劑提取物及發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抑制作用不同：菌絲體甲醇、正丁醇提取物和發(fā)酵液對(duì)4種指示菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用，最低抑菌質(zhì)量濃度為0.1563～0.625mg/mL，具有廣譜的抑菌活性，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性不隨溫度的升高而發(fā)生劇烈變化，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，由此推斷，桑黃抑菌活性物質(zhì)的主要存在部位為菌絲體甲醇、正丁醇提取物及發(fā)酵液；與此同時(shí)，菌絲體正丁醇提取物對(duì)4種指示菌的抑菌率均最高，且最低抑菌質(zhì)量濃度僅為0.1563～0.3125mg/mL，從而說(shuō)明桑黃菌絲體正丁醇提取物的抑菌能力最強(qiáng)。

通過(guò)對(duì)活性成分的初步檢測(cè)，桑黃菌絲體甲醇、正丁醇提取物中主要含有黃酮類物質(zhì)。因此，桑黃菌絲體中所含的黃酮類物質(zhì)可能具有較高的抑菌活性。而發(fā)酵液所表現(xiàn)出來(lái)的抑菌作用可能與發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶類活性物質(zhì)有關(guān)，也可能是由于液體發(fā)酵時(shí)菌絲斷裂而產(chǎn)生抗生素或釋放出了抗生素物質(zhì)，對(duì)于桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] 劉波. 中國(guó)藥用真菌[M]. 太原: 山西人民出版社, 1974: 71-73.

[2] 卯曉嵐. 中國(guó)大型真菌[M]. 鄭州: 河南科技出版社, 2000: 465-468;477.

[3] 呂英華, 王建芳, 李玉平, 等. 藥用真菌桑黃的研究進(jìn)展[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2009, 35 (1): 204-210.

[4] IKEKAWA T, NAKANISHI M, UEHARA N, et al. Antitumor action of some basidiomycetes, especially Phellinus linteus[J]. Gann, 1968, 59(9):155-157.

[5] AJITH T A, JANARDHANAN K K. Cytotoxic and antitumor activities of a polypore macrofungus, Phellinus rimosus (Berk) Pilat[J]. J Ethnopharmacol, 2003, 84(2): 157-162.

[6] BAE J S, JANG K H, PARK S C, et al. Inhibitory effects of polysaccharides isolated from Phellinus gilvus on benzo (a) pyrene-induced forestomach carcinogenesis in mice[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(4):577-579.

[7] KIM G Y, CHOI G S, LEE S H,et al. Acidic polysaccharide isolated from Phellinus linteus enhances through the up-regulation of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha from peritoneal macrophages[J]. J Ethnopharmacol, 2004, 95(1): 69-76.

[8] 宋力, 孫培龍, 郭彬彬, 等. 桑黃的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食用菌, 2005,24(3): 7-15.

[9] 胡文彬, 馬海樂(lè), 周存山. 桑黃菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件研究[J]. 中國(guó)食用菌, 2006, 25(3): 49-52.

[10] 雷萍, 孫悅迎, 張文雋, 等. 野生桑黃菌種分離與培養(yǎng)特性研究初報(bào)[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2007, 14(2): 71-75.

[11] 孫培龍, 徐雙陽(yáng), 楊開(kāi), 等. 珍稀藥用真菌桑黃的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào), 2006, 33(2): 119-132.

[12] 章海燕, 王立, 張暉. 烏飯樹(shù)樹(shù)葉不同提取物抑菌作用的初步研究[J]. 食品科技, 2010, 17(1): 34-37.

[13] 楊全, 胡旭光, 王琦, 等. 藥用真菌桑黃菌絲體多糖抗腫瘤作用的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2006, 31 (20): 1713-1715.

[14] 姜寧, 劉曉鵬, 吳紅江, 等. 金針菇菌絲體多糖超聲提取工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8): 289-292.

[15] 沈萍, 范秀容, 李廣武, 等. 微生物學(xué)試驗(yàn)[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999: 69-72.

[16] 馬利華, 秦衛(wèi)東, 陳學(xué)紅, 等. 牛蒡提取物抑菌活性的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(21): 24-27.

[17] 吐?tīng)栠d娜依·迪力夏提, 穆拉丁·庫(kù)熱西, 阿不都拉·阿巴斯.菊苣莖乙醇提取物抑菌活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(11): 80-82.

[18] 侯美珍, 韋紅群, 潘英明. 紫草不同溶劑提取物抑菌活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2006, 27(11): 52-55.

[19] 楊全, 李艷輝, 王琦, 等. 藥用真菌桑黃液體發(fā)酵工藝的研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 20(3): 212-215.

[20] 傅海慶, 陳紹軍, 駱文燦, 等. 桑黃菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2007, 7 (3): 58-63.

[21] HAN S B, LEE C W, KANG J S, et al. Acidic polysaccharide from Phellinus linteus inhibits melanoma a cell metastasis by blocking cell adhesion and invasion[J]. Int Immunopharm Acol, 2006, 6(4): 697-702.

[22] OH G S, LEE M S, PAE H O, et al. Effects of oral administration of Phellinus linteus on the production of Th1 and Th2 type cytokines in mice[J]. Immunopharmacol Immunot, 2006, 28(2): 281-293.

[23] JONG M H, CHUN H Y, SEUNG H H, et al. Antibacterial effect of Phellinus linteus against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Fitoterapia, 2004, 75(6): 603-605.

Antibacterial Activity Evaluation of Fermentation Supernatant and Mycelia of Phellinus igniarius

MENG Qing-long1，PAN Jing-zhi2，CHEN Li1，WANG Qi1,*
(1. Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Changchun City Hospital for Infectious Disease, Changchun 130123, China)

Paper disk and double dilution methods were used to study the inhibition activities and thermal stability of different extracts from mycelia and fermentation broth of Phellinus igniarius. The results showed that the inhibition effects of its methanol,n-butanol extracts of mycelia and fermentation broth on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonellae enteritidis, and Salmonella typhimurium existed, and the extracts were heat stable to Staphylococcus aureus. Meanwhile, the highest rate on inhibition against 4 indicator bacteria was n-butanol extracts from mycelia of P. igniarius, and the minimal inhibitory concentration was 0.1563－0.3125 mg/mL, which showed that its n-butanol extracts had strong antimicrobial activity.

Phellinys igniarius；fermentation products；extract；fermentation broth；antibacterial activity

R285.5

A

1002-6630(2011)03-0056-04

2010-05-20

長(zhǎng)春凈月經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)資助項(xiàng)目(20060529)

孟慶龍(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱镁飳W(xué)。E-mail：mengqinglong1985@sina.com

*通信作者：王琦(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱镁飳W(xué)。E-mail：qwang2003@hotmail.com