蘇秀芳，黃麗娟，馮佩珍

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系，廣西 崇左 532200)

細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油成分及抑菌作用

蘇秀芳，黃麗娟，馮佩珍

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程系，廣西 崇左 532200)

目的：研究細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油的成分及抑菌作用。方法：以水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，用GC-MS對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析；采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果：揮發(fā)油的主要成分為：4 -甲氧基- 6 -(2 -丙烯基) -1,3-亞甲二氧基苯(47.07%)、1,2,3-三甲氧基-5-(2-丙烯基)苯(8.25%)、2,6 -二甲氧基-4-(2 -丙烯基-苯酚)(7.17%)、正十六烷酸(7.05%)及二十三烷(4.95%)；細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，最低抑菌劑量分別為0.35mg/片、0.09mg/片、0.17mg/片及0.17mg/片。

細(xì)葉黃皮；揮發(fā)油；化學(xué)成分；抑菌作用

蕓香科柑橘亞科黃皮屬細(xì)葉黃皮[Clausena anisumolens (Blanco.)Merr]，多年生常綠大灌木或小喬木，主產(chǎn)于我國(guó)廣西西南部、云南南部、廣東新會(huì)及越南北部和菲律賓[1-2]。細(xì)葉黃皮為珍稀佳果，果皮、果肉、果仁均可食用，果實(shí)可助食消暑、消積去滯、祛痰化氣、疏通腸胃[3]，廣西西南部民間常以食用果仁用于治療胃脹氣。枝葉可做草藥，祛風(fēng)除濕[1]。

黃皮屬植物主要成分為生物堿類、香豆素類、甾醇類化合物、黃酮苷類和揮發(fā)性成分等。該屬植物具有保肝解毒、抑菌、促智、解痙攣、降血糖、抗腫瘤及抗HIV病毒等生物活性。Wang等[4]從細(xì)葉黃皮中提取到7個(gè)化合物，分別為anisumarin、isoscopoletin、umbelliferone、anisocoumarin H、capnolactone、aurapten 和7-[(E)-7'-hydroxy-3',7'-dimethylocta-2',5-dienyloxy]-coumar。汪云松等[5]從細(xì)葉黃皮中提取分離了5個(gè)化合物，分別為4-(3-methoxyphenyl-4-O-β-D-glucopyanoside)-2-butanone、3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid、3-(3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid、3-(3-methoxyphenyl-4-hydroxy)-2-propenoic acid、3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic methyl ester、3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid。

研究表明，該屬植物具有豐富的揮發(fā)性成分，不同種類、相同產(chǎn)地不同部分或不同產(chǎn)地相同部分的揮發(fā)性成分往往差異較大。蘇秀芳[6]報(bào)道廣西龍州細(xì)葉黃皮葉的揮發(fā)油成分的主要化合物類型為烯類、酸類及醇類，其中烯類占揮發(fā)油總質(zhì)量的80.79%，主要成分為4-甲氧基6-(2-丙烯基)-1,3苯并二惡唑、(+)-4-蒈烯、大根香葉烯B、十六烷酸及1,2,3-三甲氧基5-(2-丙烯基-苯)；余燾等[7]報(bào)道廣西崇左邊境細(xì)葉黃皮葉揮發(fā)油的主要成分為萜品油烯、肉豆寇醚、3-蒈烯、β-月桂烯、(+)-4-蒈烯；羅輝等[8]報(bào)道湛江產(chǎn)黃皮葉的揮發(fā)油主要成分為順-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇、β-石竹烯、α-呢烯等；廖華衛(wèi)等[9]報(bào)道廣州產(chǎn)黃皮果皮的揮發(fā)油主要成分為β-水芹烯、1R-α-蒎烯、α-水芹烯等；李瑞珍等[10]從廣州黃皮果中揮發(fā)油中鑒定出64種成分，主要成分為4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇、松油烯、3,7,7-三甲基-二環(huán)[4.1.0]己-2-烯；唐聞寧等[11]從?？诋a(chǎn)黃皮果揮發(fā)油中分離鑒定出43種成分，主要為萜品烯-4醇、檜萜、γ-松油烯、α-松油烯等；張建和等[12]報(bào)道黃皮果核揮發(fā)油主要成分為萜類化合物，γ-蒎烯占60.36%、檸檬烯占22.62%。徐漢虹等[13]報(bào)道齒葉黃皮精油具有一定的殺蟲活性，使用20mg/L的劑量進(jìn)行熏蒸或0.2%劑量拌種都能有效地殺滅赤擬谷盜(Tribolium castaneum)成蟲或抑制其種群繁殖。

該屬植物的揮發(fā)油的主要成分為烯類，報(bào)道表明該屬植物揮發(fā)油具有一定的殺蟲活性，但抑菌活性鮮有報(bào)道。有關(guān)細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油化學(xué)成分未見有報(bào)道，為了揭示其藥理作用，為開發(fā)利用細(xì)葉黃皮資源提供科學(xué)依據(jù)，本研究用GC-MS對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析，并對(duì)其藥理活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)葉黃皮成熟果實(shí)摘自廣西民族師范學(xué)院龍州校區(qū)院內(nèi)，由該?；瘜W(xué)與生物工程系黃秋嬋副教授鑒定為Clausena anisum-olens，去掉果肉及果皮，陰干后粉碎；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，殺螟桿菌(Bacillus cereus)，以上菌種均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、M-H肉湯 (自制)；石油醚、山梨酸鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HP6890/HP5973MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；RE5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化設(shè)備儀器有限公司；SHB-(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；LDZX-50KBS型立式電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C1214B型垂直流超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SPH-211B搖床培養(yǎng)箱 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)油提取

細(xì)葉黃皮果仁曬干，粉碎，稱取100g，用常規(guī)方法水蒸氣蒸餾6h。餾出液加入50mL石油醚萃取3次，合并萃取液。加入少量無(wú)水Na2SO4，靜置10h?；厥杖軇命S色油狀物，具有濃郁香味，稱量得503mg，得油率為0.503%。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

氣相色譜條件：石英毛細(xì)管柱HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)，程序升溫：從60℃開始，以4℃/min升到150℃，再以8℃/min升溫到250℃；載氣為He，柱流量1.0mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比50:1。

質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍10～500u，進(jìn)樣量1.0μL。

1.3.3 細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油抑菌活性

1.3.3.1 細(xì)菌懸液的制備

將4種供試菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于33℃下培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌種活化?；罨蟮募?xì)菌作10倍系列稀釋，并活菌計(jì)數(shù)。用M-H肉湯將細(xì)菌分別配制成5×105CFU/mL的懸浮液。

1.3.3.2 抑菌圈的測(cè)定

小濾紙片(6mm)，放入干燥培養(yǎng)皿中，用立式電熱壓力蒸氣滅菌器，在氣壓121℃下滅菌25min。

揮發(fā)油用石油醚對(duì)半稀釋為系列濃度，山梨酸鉀用無(wú)菌水稀釋，將小濾紙片分別浸泡12h。用移液槍移取每種菌種分別放入培養(yǎng)皿中，把培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，使菌懸液與培養(yǎng)基混合均勻，制成平板。將試藥浸泡的紙片置于平板內(nèi)，于35℃左右恒溫培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果。如果濾紙片周圍無(wú)菌則說(shuō)明有抑菌作用，即有抑菌圈。有明顯抑菌作用的測(cè)其抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油的化學(xué)成分

按色譜條件和質(zhì)譜條件對(duì)細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站檢索NIST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，以及查對(duì)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜文獻(xiàn)，鑒定了2 0種成分，結(jié)果見表1。

圖1 細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油的總離子流量圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile nutlet oil from Clausena anisum-olenas

表1 細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油的化學(xué)成分Table1 Chemical constituents of volatile nutlet oil from Clausena anisum-olenas

通過(guò)GC-MS分析，從揮發(fā)油中共分離出 20種成分，共鑒定了20個(gè)組分。由表1可知，細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油的主要化學(xué)成分為4-甲氧基-6-(2-丙烯基)-1,3-亞甲二氧基苯(47.07%)、1,2,3-三甲氧基-5-(2-丙烯基)苯(8.25%)、2,6 -二甲氧基-4-(2-丙烯基-苯酚)(7.17%)、正十六烷酸(7.05%)及二十三烷(4.95%)。

2.2 揮發(fā)油的抑菌結(jié)果

表2 細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油的抑菌圈直徑Table2 Diameters of inhibition zone of volatile nutlet oil from Clausena anisum-olena mm

由表2可知，細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，最低抑菌劑量分別為0.35mg/片、0.09mg/片、0.17mg/片及0.17mg/片，比食品常用的防腐劑山梨酸鉀抑菌作用強(qiáng)。

3 結(jié) 論

研究表明，細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油含量較高，主要成分為含氧化合物，占揮發(fā)油總量的78.53%，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

4 討 論

該屬植物的揮發(fā)油主要化合物類型為烯類，而細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油芳香類的成分比例較多，且芳香類分子中同時(shí)含有氧原子及雙鍵，這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其具有抑菌活性。結(jié)果表明，細(xì)葉黃皮果仁揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)抑制作用，有關(guān)活性機(jī)理值得深入研究。

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997, 43(2): 138.

[2] 黃峰, 何銑揚(yáng), 雷艷梅. 極具發(fā)展前景的細(xì)葉黃皮果[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè), 2005(4): 30-31.

[3] 譚江文, 黃永平. 細(xì)葉黃皮是石山貧困地區(qū)農(nóng)民增收致富門路: 關(guān)于龍州、崇左、扶綏等縣發(fā)展細(xì)葉黃皮的調(diào)查[J]. 廣西林業(yè), 2004(4): 22-23.

[4] WANG Yunsong, HUANG Rong, LI Ningzhong, et al. Coumarins from Clausum-olens Merr[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(7):100143-1-2。

[5] 汪云松, 沈月毛, 何紅平. 河口細(xì)葉黃皮化學(xué)成分研究[J]. 有機(jī)化學(xué),2003, 23(增刊1): 144.

[6] 蘇秀芳. GC-MS法分析雞皮果葉揮發(fā)油的化學(xué)成分[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(25): 10956-10957.

[7] 余燾, 楊姝麗, 孫建華, 等. 雞皮果葉揮發(fā)油的重復(fù)萃取及氣相色譜-質(zhì)譜法分析[J]. 廣西農(nóng)學(xué)報(bào), 2009(4): 35-36.

[8] 羅輝, 蔡春, 張建和, 等. 黃皮葉揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J]. 中藥材, 1998(8): 405-406.

[9] 廖華衛(wèi), 鄧金梅, 黃敏儀. 黃皮果皮揮發(fā)油成分研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2006(2): 139-141.

[10] 李瑞珍, 廖華衛(wèi), 陳飛苑. 廣州黃皮果揮發(fā)油成分研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2007(2): 141-143.

[11] 唐聞寧, 康文藝, 穆淑珍, 等. 黃皮果揮發(fā)油成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2002(2): 26-28.

[12] 張建和, 蔡春, 羅輝, 等. 黃皮果核揮發(fā)油成分的研究[J]. 中藥材,1997, 20(10): 518-519.

[13] 徐漢虹, 趙善歡, 朱亮鋒, 等. 齒葉黃皮精油的殺蟲作用與有效成分研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 15(2): 56-60.

Chemical Composition Analysis and Antimicrobial Activity of Volatile Oil from the Nutlets of Clausena anisum-olens

SU Xiu-fang， HUANG Li-juan，F(xiàn)ENG Pei-zhen
( Department of Chemistry and Biological Engineering, Guangxi Normal Universty for Nationalities, Chongzuo 532200, China)

Objective: To study the chemical constituents and antimicrobial activity of volatile oil from the nutlets of Clausena anisum-olenas. Methods: The volatile oil was extracted by steam distillation and then analyzed by GC-MS. The disk diffusion method was used for antimicrobial activity analysis. Results: The major chemical compositions identified in nutlet oil from the plant were 4-methoxy-6-(2-propenyl)-1,3- benzodioxole (47.07%), 1,2,3-trimethoxy-5-(2-propenyl)- benzene (8.25%), 2,6-dimethoxy-4-(2-propenyl)-pheno (7.17%), n-hexadecanoic acid (7.05%) and tricosane (4.95%). The volatile oil had strong inhibitory effect against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus cereus with minimal inhibitory concentration (MIC) of 0.35, 0.09, 0.17 mg/disc and 0.17 mg/disc, respectively.

Clausena anisum-olens；volatile oil；chemical constituents；antimicrobial activity

TQ420.7

A

1002-6630(2011)03-0030-03

2010-05-28

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010GXNSFA013050)

蘇秀芳(1971—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分的提取、分離、分析及藥理活性。E-mail：suxiufang_88@sina.com