雷生姣，王可興，呂曉燕，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

生物工程作為新技術(shù)革命的前沿發(fā)展領(lǐng)域，將在人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而酶的固定化及酶促反應(yīng)是最具發(fā)展前景的生物技術(shù)工程[1]。固定化酶技術(shù)除具有酶催化反應(yīng)特性外，還能在一定程度上解決酶穩(wěn)定性和重復(fù)利用等問題，可適應(yīng)工業(yè)化批量生產(chǎn)的要求。作為生物催化劑，固定化酶已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、制藥以及食品工業(yè)，因而固定化酶載體的開發(fā)和利用顯得尤為重要[2]。聚乙烯醇(PVA)是一種新型的固定化載體，具有機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但由于其具有極強(qiáng)的附聚性，使得其凝膠在制備凝膠珠體時(shí)比較困難，不易成型。另一種被廣泛應(yīng)用的固定化酶載體——海藻酸鈣凝膠含水率高，成形簡單容易，但其網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸太大且凝膠珠機(jī)械強(qiáng)度較差，重復(fù)使用率不高。如果將兩者進(jìn)行優(yōu)勢互補(bǔ)，采用復(fù)合法制備凝膠，則復(fù)合凝膠能滿足優(yōu)質(zhì)固定化載體的要求[3]。

柚苷酶(EC3.2.1.40)具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，是一種胞外酶，在pH2.5～6.0具有實(shí)用活性，40℃以下活性較高[4]。用于生產(chǎn)柚苷酶的真菌主要為曲霉屬和青霉屬。2000年，Zverlov等[5]將編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因進(jìn)行克隆并導(dǎo)入埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)中，該基因在埃希氏大腸桿菌中成功的進(jìn)行了表達(dá)。重組技術(shù)使得柚苷酶更易獲得且更經(jīng)濟(jì)，在食品工業(yè)和制藥工業(yè)將獲得更大的用途。柚苷酶中的α-L-鼠李糖苷酶能將柑橘汁中的苦味物質(zhì)——柚皮苷水解為鼠李糖和普魯寧(苦味約為柚皮苷的三分之一)，而普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下能被水解成柚皮素(無苦味)和葡萄糖。國外已有一些報(bào)道將柚苷酶固定在不同的載體上后應(yīng)用于柑橘汁的脫苦[6-8]和增加葡萄酒的風(fēng)味[9]，并取得了一定的效果。我國對(duì)柚苷酶的研究起步較晚，且主要集中在對(duì)柚苷酶產(chǎn)生菌的選育與篩選上[10-12]，對(duì)其在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究較少，對(duì)其固定化的研究處于起步階段。

本實(shí)驗(yàn)以聚乙烯醇和海藻酸鈣為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用延時(shí)包埋法[13]，制備性質(zhì)穩(wěn)定的固定化柚苷酶聚乙烯醇凝珠。針對(duì)該載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)固定化酶載體制備條件的優(yōu)化進(jìn)行考察，同時(shí)對(duì)固定化酶與游離酶的性質(zhì)進(jìn)行比較研究，為固定化柚苷酶的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚苷酶(CAS 號(hào)：9068-31-9)、柚皮苷(HLPC 98%)美國Sigma-Aldrich公司；聚乙烯醇((1750±50)u)、一縮二乙二醇(DEG)(化學(xué)純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海藻酸鈉(化學(xué)純) 上?；瘜W(xué)試劑分裝廠。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3000N型掃描電鏡 日本Hitachi公司；UV-7504型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；410A型pH計(jì) 美國Thermo Orion公司；HHS-型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚苷酶活力的測定

游離酶活力測定[14]：5mL具塞試管中加入0.6mL底物柚皮苷(500μg/mL)和0.3mL醋酸緩沖液(0.2mol/L，pH4.0)，在60℃的恒溫水浴鍋中保溫5min后立即加入0.1mL柚苷酶液(2.0mg/mL)，置入60℃的恒溫振蕩器(150r/min)中準(zhǔn)確反應(yīng) 30min；取出反應(yīng)液，添加4mL蒸餾水和4.9mL體積分?jǐn)?shù)90%的一縮二乙二醇 (DEG)，40℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱3～5min，再加入4.0mol/L NaOH 0.1mL，充分搖勻，在水浴鍋中保溫發(fā)色10min；取出注入1cm比色皿內(nèi)，用紫外分光光度計(jì)在420nm波長處測定吸光度，通過柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。以0～250μg/mL 柚皮苷為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定420nm波長時(shí)的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)以0.1mL醋酸緩沖液代替酶液作對(duì)照，以緩沖液作空白。

固定化酶活力測定：方法與游離酶活力測定基本相同，只需將酶液用1g固定化酶凝珠代替，將0.3mL緩沖液添加至0.4mL即可，其他均相同。

酶活力定義(U)：在測定條件下(60℃，pH4.0)，每分鐘消耗1μg柚皮苷所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

游離酶或固定化酶相對(duì)活力是指在同組實(shí)驗(yàn)中以活力最高的為100，與其余的游離酶或固定化酶的活力之比，以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.2 固定化酶凝膠顆粒的制備

按9.0g/100mL的PVA和1.0g/100mL的海藻酸鈉比例配制100g載體溶液，待溶液完全冷卻后，加入體積分?jǐn)?shù)2.0%的戊二醛，充分混勻，置室溫下交聯(lián)3h。在延時(shí)交聯(lián)后的載體中加入10mL(2.0mg/mL)的酶液，充分混勻后于15℃的恒溫振蕩器(150r/min)中吸附10h，再用5mL注射器均勻地注入4.0g/100mL的硼酸和0.5g/100mL的CaCl2溶液中形成3～5mm的凝珠，于4℃冰箱中固化1h后，用蒸餾水潤洗3次；最后置于－40℃的冰柜中凍存30min，4℃冰箱中解凍，如此往復(fù)循環(huán)3次后[15]，用濾紙吸干凝珠表面的水分，存放于4℃冰箱中冷藏待用。

1.3.3 游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

在最佳固定化條件下，制得PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶，按照酶活力測定方法，分別測定游離酶與固定酶的酶活。將底物柚皮苷溶液配制成不同pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH2.8～5.2)，分別向不同pH值的底物溶液中加入游離酶或固定化酶，60℃反應(yīng)30min后測定酶活力，確定游離酶與固定化酶的最適pH值；將游離酶與固定化酶分別置于不同溫度(30～80℃)的水浴鍋中反應(yīng)30min后，取樣測定酶活力，確定游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)溫度；將游離酶或固定化酶與不同質(zhì)量濃度底物柚皮苷溶液作用，測定反應(yīng)初速度，用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法求出酶的Km值；將游離酶與固定化酶分別在60℃的水浴鍋中保溫不同的時(shí)間后，取樣在最適反應(yīng)溫度下測定酶活力，比較游離酶與固定化酶的溫度耐受性；將固定化酶與底物柚皮苷溶液反應(yīng)完成后，取出用0.2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)洗滌至無反應(yīng)產(chǎn)物殘留，重新裝入新鮮底物溶液，測定固定酶活力，以此進(jìn)行多次水解循環(huán)來測定固定化酶的重復(fù)使用性。

1.3.4 PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶

配制9.0g/100mL聚乙烯醇和1.0g/100mL海藻酸鈉載體溶液100g，待溶液完全冷卻后，按不同固定化方法制備固定化酶，具體如下：將100g載體溶液平均分成4份，其中兩份不加戊二醛，兩份按2%比例(占總體積)加入戊二醛；再分別將一份未加戊二醛和一份添加了戊二醛的載體溶液置室溫下自交聯(lián)3h；另兩份即刻加入2.5mL(2.0mg/mL) 的酶液，再按固定化酶凝膠顆粒的后續(xù)制備方法制備固定化酶；自交聯(lián)的載體溶液交聯(lián)3h后，即刻加入2.5mL(2.0mg/mL)的酶液，同樣按固定化酶凝膠顆粒的后續(xù)制備方法制備固定化酶。按酶活力測定方法測定固定化酶的相對(duì)活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶工藝條件優(yōu)化

2.1.1 PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶方法的確定

圖1 不同固定化方法對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of different immobilization methods on activity of naringinase

由圖1可知，采用添加戊二醛和延時(shí)交聯(lián)的包埋方法制備的固定化酶活力較高。這主要是因?yàn)槲於┦且环N雙功能交聯(lián)劑，有二個(gè)醛基，可以使PVA-海藻酸鈉分子內(nèi)和分子間相互形成交聯(lián)，同時(shí)也可以使酶交聯(lián)在載體上。適宜的戊二醛使得PVA-海藻酸鈉分子能形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高酶的固定化率。所以，在優(yōu)化固定化條件時(shí)，確定載體的交聯(lián)時(shí)間為3h和較適宜的戊二醛體積分?jǐn)?shù)為2.0%。

2.1.2 不同質(zhì)量濃度PVA-海藻酸鈉配比對(duì)固定化作用的影響

按表1中的PVA-海藻酸鈉的配制不同質(zhì)量濃度的混合載體溶液，再按1.3.2節(jié)方法不改變其他條件制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對(duì)酶活力。

表1 PVA-海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活力的影響Table 1 Effect of PVA-alginate concentration on activity of immobilized naringinase

由表1可知，以9.0g/100mL的PVA溶液固定化柚苷酶時(shí)，固定化酶的相對(duì)酶活力較高，且凝珠易成型，珠體光潔、圓整，并具有適中的凝膠強(qiáng)度；當(dāng)PVA質(zhì)量濃度過低時(shí)，凝珠成型時(shí)間較長，且不易成型，凝膠強(qiáng)度也較弱；但當(dāng)PVA質(zhì)量濃度過高時(shí)，由于溶液黏度較高，凝珠不易成球，而且推壓針筒時(shí)感到非常費(fèi)力，有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。海藻酸鈉的質(zhì)量濃度同樣也影響著酶的固定率，海藻酸鈉質(zhì)量濃度過高時(shí)，溶液的黏度較高，不利于凝珠的成型，固定化酶的相對(duì)酶活力也有所下降，這主要是因?yàn)檩^多的海藻酸鈣導(dǎo)致了固定化顆粒內(nèi)部孔徑的減少，影響底物柚皮苷與酶的接觸及產(chǎn)物的傳質(zhì)；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度過低時(shí)，形成的凝膠強(qiáng)度較低。因此，按9.0g/100mL的PVA與1.0g/100mL的海藻酸鈉配比制備載體時(shí)，固定化酶的相對(duì)酶活力最高，此條件下固定化有利于酶活力的發(fā)揮和產(chǎn)物的傳出。

2.1.3 固化液CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響

按1.3.2節(jié)的方法，其他固定化條件不變，分別加入不同質(zhì)量濃度的固化液CaCl2溶液，制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對(duì)活力，結(jié)果如圖2所示。

圖2 CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of CaCl2 concentration on activity of immobilized naringinase

實(shí)驗(yàn)過程中，固化液中4.0g/100mL硼酸的量是過量的[16]，因此不需要進(jìn)行優(yōu)化，但CaCl2的質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響較大。當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度過低時(shí)，制備的凝膠顆粒較軟，形成的凝膠網(wǎng)狀孔徑比較大，截留的酶較少，在水解柚皮苷過程中易損壞，影響水解的效率；當(dāng)其質(zhì)量濃度過高時(shí)，由于過多的Ca2+使網(wǎng)狀孔徑過小，且導(dǎo)致了載體部分孔徑的被堵塞，使得固定化酶的相對(duì)酶活力降低。1.0g/100mL CaCl2所制作的固定化酶凝珠易成型，形狀均勻、具有彈性，無拖尾現(xiàn)象，且制備的固定酶的相對(duì)酶活力最高。因此，固化液中選擇1.0g/100mL為最佳的CaCl2質(zhì)量濃度。

2.1.4 酶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化效果的影響

按1.3.2節(jié)的方法，其他固定化條件不變，分別加入不同質(zhì)量濃度的柚苷酶溶液，制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖3所示。酶液質(zhì)量濃度在0.5～2.0mg/mL時(shí)，隨著酶液質(zhì)量濃度的增大，固定化酶的相對(duì)酶活力快速增加。當(dāng)酶液質(zhì)量濃度增至2.0mg/mL時(shí)，固定化酶的相對(duì)酶活力開始緩慢增加。即對(duì)于柚苷酶來說，酶液質(zhì)量濃度的最佳值為2.0mg/mL。這是因?yàn)楫?dāng)酶液質(zhì)量濃度變大時(shí)，單位質(zhì)量載體上固定的酶也就增加，相對(duì)酶活力隨之就增加；但是當(dāng)酶液質(zhì)量濃度增大至一定程度時(shí)，載體上吸附的酶量逐漸達(dá)到平衡，此時(shí)酶的相對(duì)活力就相對(duì)增加緩慢；另外，當(dāng)載體對(duì)酶的吸附量達(dá)到飽和時(shí)，有些酶分子進(jìn)入載體深處，底物擴(kuò)散相對(duì)困難，使酶分子發(fā)揮作用的能力減弱。因此，選擇2.0mg/mL的酶液，進(jìn)行固定化。

圖3 酶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on activity of immobilized naringinase

2.1.5 酶交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

按1.3.2節(jié)的方法，其他固定化條件不變，改變固定化酶的吸附時(shí)間，制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of crossing time on activity of immobilized naringinase

本實(shí)驗(yàn)固定化酶的方法采用交聯(lián)與包埋結(jié)合法。由于該載體表面及內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，分子在載體內(nèi)部的擴(kuò)散反應(yīng)需要一定時(shí)間。從圖4可知，固定化時(shí)間在1～10h內(nèi)，時(shí)間越短，酶的固定化率越低；但超過10h，隨著時(shí)間的延長，酶的固定率逐步下降。這是因?yàn)槿绻潭ɑ瘯r(shí)間太長，交聯(lián)程度高，形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)太緊密，就會(huì)影響到酶促反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)速率，檢測到的固定化酶的活力就會(huì)下降。因此選擇固定化酶的吸附時(shí)間為10h，就能獲得較多活力。

2.2 固定化酶的掃描電鏡(SEM)

在最佳的固定化條件下得到固定化柚苷酶，在掃描電鏡下觀察載體橫截面。濕的PVA-海藻酸鈉微球經(jīng)SEM觀察前要進(jìn)行如下幾步處理：1)用0.1mol/L PBS(pH7.2)清洗3次(每次20min)后，在室溫下用體積分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨固定2.5h，然后再用0.1mol/L PBS(pH7.2)清洗3次(每次30min)；2)將清洗后的材料分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇逐級(jí)脫水3次(每次30min)，再用乙酸異戊酯-乙醇體積比為1:1的混合溶液代換1次，體積分?jǐn)?shù)100%的乙酸異戊酯代換1次(30min)；3)將充分脫水后的樣品放入CO2臨界點(diǎn)干燥儀(HCP-2型)中干燥，干燥后的微球經(jīng)離子濺射儀(EikoIB-5)鍍金膜后SEM觀察拍照，加速電壓為20kV。

對(duì)固定化酶而言，載體結(jié)構(gòu)直接影響著固定化酶的活性。多孔且具有較高比表面積的高分子微球，被認(rèn)為是固定化酶的理想結(jié)構(gòu)。由圖5可看出，載體孔結(jié)構(gòu)內(nèi)外相連，表面存在大量孔徑50nm左右的孔結(jié)構(gòu)，具有較大比表面積。因而酶固定在載體上后，酶分子被束縛在有限的空間結(jié)構(gòu)內(nèi)，使得酶分子無法自由變構(gòu)，從而保持了酶的活性[17]。

圖5 PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶的SEM圖(×5000)Fig.5 SEM of the surface configuration of immobilized naringinase with PVA-sodium alginate (×5000)

2.3 游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 游離酶與固定化酶的最適pH值

在不同pH值的0.2mol/L的醋酸緩沖溶液中，測定游離酶和固定化酶的相對(duì)活力。由圖6可知，該固定化酶與游離酶的最適pH值均為4.0，說明PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶后對(duì)酶反應(yīng)的最適pH值沒有影響。當(dāng)pH值低于4.0時(shí)，游離酶的相對(duì)酶活力較固定化酶高，但pH值大于4.0后，固定化酶的活力下降緩慢，游離酶的活力下降迅速；同時(shí)，固定化酶對(duì)pH值的敏感度較游離酶低，適應(yīng)的范圍比較廣。

圖6 游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)pH值Fig.6 Optimal reaction pH of free and immobilized naringinase

2.3.2 游離酶與固定化酶的最適溫度

圖7 游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)溫度Fig.7 Optimal reaction temperature of free and immobilized naringinase

從圖7可知，固定化酶與游離酶在溫度30～70℃范圍內(nèi)相對(duì)酶活力隨溫度升高而增大，在70℃時(shí)，相對(duì)酶活力均達(dá)到最大。這表明柚苷酶固定化后對(duì)其最適溫度沒有影響。但溫度高于70℃后，由于PVA在高溫下能溶解，因此固定化酶的使用溫度不能高于此溫度；游離酶在溫度高于70℃時(shí)，相對(duì)酶活力迅速下降，因此也不適宜在此溫度范圍內(nèi)使用。因而，固定化酶與游離酶的最適溫度均為70℃。

2.3.3 游離酶與固定化酶的動(dòng)力學(xué)行為

酶經(jīng)過固定化后，酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定程度的變化；同時(shí)由于載體的影響，與底物的親和力也會(huì)發(fā)生改變。圖8為游離酶與固定酶的Lineweaver-Burk曲線，并求得固定化酶及游離酶的Km分別為4.263mmol/L和 2.747mmol/L。由此可知，固定化酶的Km值高于游離酶。Km大，表示酶與底物的親和力小，反之，表示酶與底物的親和力大。這說明柚苷酶經(jīng)過PVA-海藻酸鈉載體固定化后，其與底物的結(jié)合能力變?nèi)?。這可能是因?yàn)檩d體所帶電荷和底物所帶電荷相同時(shí)，他們之間產(chǎn)生了排斥作用；又或是因?yàn)槊附?jīng)過固定化后產(chǎn)生了立體障礙或擴(kuò)散阻力，從而導(dǎo)致Km值升高。

圖8 游離酶與固定化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.8 Lineweaver-Burk curve of free and immobilized naringinase

2.3.4 游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性

圖9 游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of free and immobilized naringinase

由圖9可知，固定化酶與游離酶在60℃時(shí)保溫90min以內(nèi)相對(duì)酶活力均沒有明顯的降低，保溫時(shí)間超過90min后游離酶活力迅速下降，而固定化酶活力下降緩慢。當(dāng)保溫時(shí)間達(dá)到150min時(shí)，游離酶相對(duì)活力僅為30.87%，而固定化酶相對(duì)活力高達(dá)72.84%，這表明固定化酶在60℃時(shí)的熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶。因此，酶和高分子載體結(jié)合后，結(jié)構(gòu)變得牢固，酶的構(gòu)相被固定，即使受熱，酶蛋白鏈也難以伸展，酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)得以維持，所以固定化酶的穩(wěn)定性顯著提高。

2.3.5 固定化酶的重復(fù)使用性

圖10 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.10 Stability of immobilized naringinase

以第一次測得的酶活力為100，計(jì)算各自相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖10所示，經(jīng)過重復(fù)使用6次后，固定化酶的相對(duì)酶活力仍保持為60%左右。這表明柚苷酶經(jīng)過固定化后具有良好的重復(fù)使用性，這為固定化柚苷酶應(yīng)用于果汁脫苦提供參考。

3 討 論

聚乙烯醇和海藻酸鈉來源豐富、無毒、化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，是性能良好的固定化酶載體，具備規(guī)模生產(chǎn)的條件。海藻酸鈉溶液可以與Ca2+離子反應(yīng)形成凝膠，凝膠可以在室溫或任何高于100℃的溫度條件下形成，加熱也不融化；而聚乙烯醇在硼酸溶液中形成的凝膠孔隙較大。結(jié)合它們的優(yōu)點(diǎn)制備的固定化酶載體，易于底物與酶的接觸和產(chǎn)物的自由流出，同時(shí)利用交聯(lián)劑——戊二醛提供的醛基，使PVA-海藻酸鈉分子內(nèi)和分子間形成交聯(lián)，提高了酶的催化效率。固定化酶凝珠內(nèi)部具有規(guī)則的通孔結(jié)構(gòu)，具有很大的內(nèi)表面積，能有效地包埋、截留柚苷酶，并且有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散。結(jié)果表明：9.0g/100mL的聚乙烯醇與1.0g/100mL的海藻酸鈉配比時(shí)，固定化酶的相對(duì)酶活力較高，催化效果較好。柚苷酶經(jīng)過固定化后，熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高了；重復(fù)使用6次，相對(duì)酶活力仍可保持60%。

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