馮增斌，王振潮，王愛輝，房大廣

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

風(fēng)濕性心臟病患者常合并心房顫動(簡稱房顫)，而房顫患者又常見左房內(nèi)附壁血栓形成，其具體機(jī)制尚不十分清楚。一氧化氮(NO)具有強(qiáng)大的抗血栓作用，能抑制血栓形成［1］。NO在心血管系統(tǒng)主要由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)合成，而eNOS RNA則是調(diào)節(jié)eNOS合成的重要基因。本課題旨在研究風(fēng)濕性心臟病合并房顫、左房內(nèi)血栓形成患者，血清中NO含量、心房組織內(nèi)eNOS的表達(dá)變化，探討風(fēng)濕性心臟病患者附壁血栓形成的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇我院2007年2月～2009年 12月行風(fēng)濕性心臟病瓣膜置換手術(shù)患者50例，術(shù)前常規(guī)行心電圖和心臟彩色多普勒檢查，根據(jù)有無房顫和附壁血栓分為3組。A組:風(fēng)濕性心臟病不伴心房顫動、未合并左房內(nèi)血栓形成患者20例，男9例、女11例，年齡(41±13)歲，其中二尖瓣狹窄13例、二尖瓣狹窄伴關(guān)閉不全7例，超聲均報告無左房內(nèi)附壁血栓，左房徑(52±14)mm，EF值47% ±10%，心功能Ⅱ～Ⅲ級。B組:風(fēng)濕性心臟病伴房顫、未合并左房內(nèi)血栓形成14例，男3例、女11例，年齡(46±13)歲，其中二尖瓣狹窄8例、二尖瓣狹窄伴關(guān)閉不全5例、二尖瓣狹窄伴關(guān)閉不全及三尖瓣關(guān)閉不全1例，均于手術(shù)前心電圖示房顫，超聲報告無左房內(nèi)附壁血栓，左房徑(52±14)mm，EF值47% ±10%，心功能Ⅱ～Ⅲ級。C組:風(fēng)濕性心臟病伴心房顫動、左房內(nèi)血栓形成患者16例，男7例、女9例，年齡(49±11)歲，其中二尖瓣狹窄5例、二尖瓣狹窄伴關(guān)閉不全7例、二尖瓣狹窄伴關(guān)閉不全及三尖瓣關(guān)閉不全患者4例，均于手術(shù)前心電圖示房顫。超聲均報告有左房內(nèi)附壁血栓并于手術(shù)中證實，左房徑(56±10)mm，EF值44% ±6%，心功能Ⅱ～Ⅲ級。以上患者均除外感染、風(fēng)濕活動、糖尿病、腦卒中、急性冠脈綜合征。

1．2 標(biāo)本制備 上述3組患者均在全麻下行心臟直視手術(shù)，術(shù)中于轉(zhuǎn)機(jī)前在左心耳處抽取血液3 ml，肝素抗凝。切取左心耳0．5 cm3大小心肌組織，結(jié)扎左心耳。心肌標(biāo)本置入液氮中保存。將血液標(biāo)本2 000 r/min離心5 min，分離血清，-20℃保存待測。

1．3 NO2-/NO3-含量測定 采用硝酸還原酶法測定血清樣品中NO2-/NO3-的含量，具體方法參照說明書，靈敏度2 μmol/L，試劑盒為南京建成生物制品公司生產(chǎn)。

1．4 eNOS蛋白表達(dá)測定 心肌組織4 μm連續(xù)切片。應(yīng)用鼠抗人eNOS抗體，即用型SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(均購自武漢博士德公司)。切片脫蠟至水，經(jīng)3%H2O2預(yù)處理，5%BSA室溫封閉20 min，鼠抗人eNOS抗體和羊抗鼠IgG抗體依次反應(yīng)和洗滌后，以DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染核，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。全部標(biāo)本實驗條件一致，PBS代替一抗作為陰性對照。以胞質(zhì)或胞膜呈均一棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性，無棕黃色顆粒者為陰性。

1．5 eNOS mRNA表達(dá)檢測 采用TRIzol提取組織總RNA，采用SYBR Green實時檢測的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測心肌組織中eNOS mRNA的表達(dá)(PE 9600熒光定量PCR儀，美國Perkin Elmer公司生產(chǎn))。PCR體系(50 μl):5×SYBR Green 10 μl，2 U/μl Taq 酶 1．5 μl，25 mmol/L dNTP 0．5 μl，10 pmol/μl上游引物 1 μl，10 pmol/μl下游引物1 μl，cDNA 模板 5 μl，雙蒸水 31 μl。反應(yīng)條件:93℃ 3 min，1個循環(huán);93 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)，于每循環(huán)延伸反應(yīng)最后時刻收集熒光信號。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，各取2．5 μl做定量PCR模板，反應(yīng)體系及條件同上，同時設(shè)定陰性對照。以稀釋倍數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)域值(Ct)為縱坐標(biāo)，ABI Prism7000軟件分析系統(tǒng)可自動繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)各待測樣本的Ct值和起始拷貝數(shù)。

1．6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，組間比較用完全隨機(jī)的單因素方差分析。以P≤0．05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 NO-2/NO-3含量 A、B、C組血清中NO-2/NO-3含量分別為(13．5 ± 1．9)、(9．2 ± 1．6)和(7．4 ±1．2)μmol/L，與A 組比較，B、C 組NO-2/NO-3含量減低，P＜0．05;B、C組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

2．2 eNOS蛋白表達(dá) eNOS蛋白陽性染色呈棕黃色顆粒，A、B、C組左心耳心肌eNOS蛋白陽性表達(dá)率分別為65%、57．1%和43．8%，B、C 組少于A 組，P ＜0．05。

2．3 eNOS mRNA表達(dá) A、B、C組左心耳心肌組織eNOS mRNA 表達(dá)量分別為(9．5±1．4)×106、(4．5 ±1．6)×106和(3．8 ±1．3)×106copies，B、C組少于 A 組，P ＜0．05。

3 討論

由于NO極不穩(wěn)定，直接測量十分困難，NO2-和NO3-是NO的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，測量NO2-和NO3-的總量可以較好地反映NO的水平。本研究表明，房顫尤其是合并有左房內(nèi)血栓患者，血清NO2-/NO3-含量明顯下降。這說明房顫尤其是合并有左房內(nèi)血栓時，血清中NO水平明顯下降［2］。

本研究結(jié)果表明，房顫患者尤其是合并有血栓患者，左房心肌組織eNOS蛋白和mRNA表達(dá)明顯下降。eNOS是內(nèi)皮細(xì)胞NO合成的限速酶，表達(dá)受血流介導(dǎo)的切變應(yīng)力調(diào)節(jié)，在低血流部位表達(dá)下調(diào)。房顫時心房喪失了節(jié)律性收縮，在心房內(nèi)形成湍流，可能引起心內(nèi)膜 eNOS表達(dá)下調(diào)及功能異常［2］。eNOS正常表達(dá)，有賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的正常，竇性心律下穩(wěn)定的層狀血流和血管剪切力等因素。任何一個因素改變都會影響eNOS的表達(dá)。心房顫動時心室有效充盈減少，血流剪切力下降，可使eNOS的表達(dá)減少［3］。另外，血流動力學(xué)紊亂，心律不規(guī)則出現(xiàn)湍流，會明顯降低eNOS的生物活性，加之內(nèi)皮細(xì)胞的損傷都會使NO的生成減少［4］。NO分泌減少使其對血小板的抑制作用減弱，纖溶酶原激活物抑制劑1表達(dá)增加，血小板易于聚集和黏附于受損的內(nèi)皮，導(dǎo)致最終促進(jìn)左房的血栓形成。因此，我們認(rèn)為左房心肌組織eNOS的蛋白和mRNA表達(dá)明顯下降，導(dǎo)致NO生成減少，可能是風(fēng)心病患者附壁血栓形成的機(jī)制。

［1］Rastaldo R，Pagliaro P，Cappello S，et al．Nitric oxide and cardic function［J］．Life Sci，2007，81(10):779-793．

［2］Cai H，Li Z，Goette A，et al．Downregulation of endocardial nitric oxide synthase expression and nitric oxide production in atrial fibrillation:potential mechanisms for atrial thrombosis and stroke ［J］．Circulation，2002，106(22):2854-2858．

［3］Bukowska A，R?cken C，Erxleben M，et al．Atrial expression of endothelial nitric oxide synthase in patients with and without atrial fibrillation ［J］．Cardiovasc Pathol，2010，19(3):51-60．

［4］Guazzi M，Arena R．Endothelial dysfunction and pathophysiological correlates in atrial fibrillation ［J］．Heart，2009，95(2):102-106．