王俊艷綜述 魏素菊審校

隨著人們對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究，乳腺癌干細胞日益受到研究者們的重視。研究表明，乳腺癌干細胞是乳腺癌組織中極少數(shù)具自我更新和多向分化能力的細胞,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。這些細胞具有化療、放療及缺氧抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉移性，在乳腺癌的發(fā)生﹑發(fā)展乃至轉移﹑復發(fā)中起著極其重要作用。本文對乳腺癌干細胞在乳腺癌研究及治療中的最新進展作一綜述。

1 乳腺癌干細胞的鑒定和分離

以往的研究證實腫瘤干細胞應具備以下特性[1]:①少量乃至單個細胞即可在免疫缺陷鼠中形成新的腫瘤；②所生成的子代腫瘤具有異質(zhì)性,既包含癌干細胞也包含一般癌細胞;③子代腫瘤需包含“源腫瘤”所有表型及遺傳特征。

1.1 ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、Lin-細胞

2003年AI-Hajj等[2]將ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、L in-細胞注入到非肥胖糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠NOD /SC ID體內(nèi),12周內(nèi)小鼠均出現(xiàn)腫瘤,而接種CD44- 或CD24+細胞的小鼠則少有腫瘤生長。生成的腫瘤細胞經(jīng)分離再接種到小鼠乳房脂肪墊中,未分類細胞需接種5×104個才能形成腫瘤,而ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、Lin- 細胞只需接種1 ×103個即能100％形成腫瘤,這說明表達ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、L in- 表面標記的細胞亞群在乳腺癌中起著干細胞樣作用。Ponti等[3]體外培養(yǎng)Oct4+及CD44+/CD24- 的人乳腺癌細胞,可產(chǎn)生分別具有腔上皮與肌上皮標記的2種癌細胞后代。Gabriella等[4]發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24- 細胞在基底樣乳腺癌和BRCA1遺傳性乳腺癌中常見,其中94％遺傳性乳腺癌含有 CD44+/ CD24 - 細胞,可見該群細胞在乳腺癌的發(fā)生中發(fā)揮著干細胞樣作用。

1.2 乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)

ALDH 是細胞內(nèi)的一組同工酶,在干細胞分化早期起著使視黃醇氧化成視黃酸的作用,ALDH1是ALDH家族的主要成員[5]。Ginestier等[6]利用ALDEFLOUR試劑檢測細胞內(nèi)ALDH活性，結果發(fā)現(xiàn)在乳腺組織的正常細胞以及癌細胞中ALDEF- LOUR陽性細胞均具有類似干細胞的自我更新和多向分化能力,而陰性細胞則不然。500個ALDEFLOUR 陽性乳腺癌細胞異種移植到去除乳腺的NOD /SCID 小鼠乳房脂肪墊中,就能形成腫瘤,而且能夠分化形成ALDEFLOUR 陰性細胞。ALDEFLOUR 陽性細胞群和CD44+ /CD24- /Lin- 細胞群有部分重疊,至少20 個表型為CD44+ /CD24- /Lin- /ALDEFLOUR陽性細胞即能形成腫瘤。Charafe-Jauffret等[7]利用相同方法分離和標記出ALDEFL OUR陽性乳腺癌細胞株,將其異種移植到NOD /SCID小鼠中可以形成腫瘤,而且由ALDEFLOUR陽性細胞形成的腫瘤中ALDEFLOUR陽性細胞與ALDEFLOUR陰性細胞的比例與其在細胞株中的比例相似。此外,在造血細胞、胰腺癌和肺癌等多種組織中ALDH1高表達[ 8，9 ],ALDH1有望成為分離和鑒別多種干細胞的共同標志。

1.3 側群細胞( sidepopulation,SP)

Hoechst33342 是DNA 增補性染料,能結合DNA的AT豐富系列的小溝處,干細胞及腫瘤干細胞因帶有ABC轉運蛋白而能將染料泵出細胞,經(jīng)過熒光活化細胞分選系統(tǒng)( fluorescence activated cell sorter,FACS)的分析,將不被染色或低染色的腫瘤干細胞篩選出來,所分選出來的染色暗淡的細胞被稱為側亞群細胞,故又稱為側群細胞分選法。Patrawala等[10 ]將從人乳腺癌細胞系MCF-7中分離得到的SP細胞移植到NOD /SC ID小鼠,移植1000個SP細胞時,17％的小鼠形成腫瘤;移植1×104個SP細胞時50％的小鼠形成腫瘤,腫瘤形成的潛伏期隨著移植SP細胞數(shù)量的增多而縮短,機制可能與SP細胞高表達Notch21和β2catenin分子有關。同時SP亞群可傳代并生成其他非SP細胞,顯示其具有自我更新和多向分化能力,提示有腫瘤干細胞特性。Engelmann等[11]發(fā)現(xiàn)MCF-7乳腺癌細胞中大多數(shù)SP細胞表型為CD44+ /CD24- / low；77.8％的SP細胞表達MUC1 ,因此以MUC1腫瘤抗原為治療靶標可以消除腫瘤干細胞,為乳腺癌的治療提供新的方案。

1.4 乳腺球(mammospheres)

乳腺上皮細胞懸浮培養(yǎng)時有一小群細胞可在不貼壁條件下形成一些漂浮的球形克隆,稱乳腺球(mammospheres)。Ponti等[3]利用此方法從乳腺癌細胞中制備乳腺球,發(fā)現(xiàn)其中大部分細胞表達CD44+CD24-表型。與乳腺癌細胞相比,千倍稀釋的乳腺球仍可在小鼠中形成腫瘤。這些乳腺球經(jīng)酶分解后,10％～20％的細胞即可形成第2代乳腺球,其后培養(yǎng)傳承40代,證明其具有自我更新能力,是一群富含腫瘤干細胞的細胞。

1.5 標記滯留細胞

溴脫氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine,BrdU)是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物,通過競爭摻入到S期細胞單鏈DNA核苷酸序列中替代胸腺嘧啶。BrdU在細胞培養(yǎng)過程中或經(jīng)活體注射加入后,利用抗BrdU單克隆抗體進行化學染色,顯示增殖細胞。如果細胞迅速分裂,BrdU就會因為被稀釋而檢測不到；如果細胞分裂緩慢,就能被檢測到,這種細胞被稱為標記滯留細胞,故該方法可以用來鑒別和定位腫瘤干細胞[12]。但乳腺癌干細胞周期似乎不斷循環(huán),而且并不是所有的干細胞都具有滯留標記,滯留標記的細胞并不一定是干細胞。因此,在乳腺癌干細胞循環(huán)周期尚未探明之前,該標志物的使用有待于進一步研究。

然而,細胞表型僅僅是鑒定和分離細胞的標記和手段,并不等于說CD44+CD24-/low ESA+Lin-的乳腺癌細胞就是乳腺癌干細胞。Al-Hajj等[2]的研究僅說明CD44+CD24-/lowESA+Lin-的細胞中富含乳腺癌干細胞。因此,欲通過細胞表面標記或特殊培養(yǎng)方法來鑒定和分離完全的乳腺癌干細胞尚需更多的研究和探索。

2 乳腺癌干細胞與腫瘤的侵襲、轉移和預后

2.1 乳腺癌干細胞與腫瘤的侵襲、轉移

Sheridan等[13]研究了13種乳腺癌細胞系中CD44+/CD24-細胞亞群與腫瘤侵襲、歸巢和轉移的關系,發(fā)現(xiàn)在CD44+/CD24-比例較高的細胞系中,與侵襲相關的基因和蛋白(IL-6、IL-8、IL-1α和UPA)的表達明顯高于CD44+/CD24-比例較低的細胞系。此研究表明,表達CD44+/CD24- 的乳腺癌細胞的含量與乳腺癌的浸潤和轉移呈正相關。Mumcuoglu等[14]最近的研究結果顯示乳腺癌的惡性程度與CD44+/CD24-細胞群分化程度直接相關，分化越差惡性程度越高。Balic等[15]對早期乳腺癌患者的骨髓標本進行了研究,通過免疫組織化學、免疫熒光等方法發(fā)現(xiàn)這些骨髓標本中存在CK+表達。所有CK+的標本中均有表達CD44+/CD24-的細胞(33％～100％,中位值65％);而原發(fā)腫瘤中CD44+/CD24-細胞的比例不超過10％。這項實驗證實了在早期乳腺癌骨髓播散分布的腫瘤細胞中多數(shù)具有乳腺癌干細胞的表型,與原發(fā)病灶存在明顯差異，提示早期乳腺癌患者骨髓中可能已經(jīng)存在轉移來的乳腺癌干細胞,從而導致治療后的轉移或復發(fā)。

2.2 乳腺癌干細胞與預后

Shipitsin等[16]研究發(fā)現(xiàn),CD44+/CD24-的乳腺癌細胞基因標志是乳腺癌患者預后差的獨立因素。Mylona等[17 ]用免疫組化雙染的方法對136例浸潤性乳腺癌的患者進行了CD44 + /CD24 - 和CD44 - /CD24 +與乳腺癌轉移及預后的關系研究,其研究表明CD44 + /CD24 -與淋巴結的轉移及腫瘤的分級呈負相關,與患者的生存率呈正相關;而CD44 - /CD24 +與臨床病理分級沒有關系,與患者的生存率呈負相關。Ginestier等[18]研究發(fā)現(xiàn),ALDH1是乳腺癌干細胞的標志之一,而且是乳腺癌患者預后差的獨立因素。Zhou等[19 ]對國際12項已發(fā)表的研究成果進行了meta分析，結果顯示乳腺癌患者的ALDH1 +(RR=2.83,95％ CI:2.16～3.67,P<0.001)以及 CD44+/CD24-/low(RR = 2.32,95％ CI:1.51～3.60,P<0.001)的腫瘤細胞的含量與患者的OS顯著相關。

3 乳腺癌干細胞與治療

現(xiàn)有的乳腺癌治療方法以殺死或清除一切腫瘤細胞為目的。但放、化療對存在于腫瘤中數(shù)量較少的干細胞樣細胞群療效非常有限，經(jīng)過治療后殘存的干細胞樣細胞群的增殖足以促使腫瘤復發(fā)和轉移。Lindeman等[20]研究表明休眠腫瘤干細胞具有化療抵抗能力。所以研究除手術外的傳統(tǒng)治療方法對干細胞樣細胞群的作用，為進一步的研究奠定基礎就尤為重要。

3.1 乳腺癌干細胞與化療

腫瘤干細胞具有細胞周期長、代謝慢的特點,因此對抗有絲分裂藥物具有較高的耐受性。Piyush等[21]發(fā)現(xiàn)鹽霉素殺死乳腺癌干細胞的能力比普通的化療藥物如紫杉醇強100倍。與被紫杉醇處理過的腫瘤干細胞相比，經(jīng)過鹽霉素處理過的腫瘤干細胞被注入到實驗鼠體內(nèi)后，成瘤幾率顯著降低，且實驗鼠腫瘤的生長速度也明顯減慢。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)乳腺癌癌相關成纖維細胞通過SDF-1通路而增加CD44+ CD24-細胞的含量，此通路有望成為化療藥物治療乳腺癌的新靶點。由于乳腺癌干細胞將化療藥物排除細胞外等多種原因而較其他癌細胞具有更強的化療藥物耐受性，因此，增強腫瘤干細胞對化療藥物的敏感性是迫切需要解決的問題之一。

3.2 乳腺癌干細胞與放療

自腫瘤干細胞學說提出以來就有推測其對放療可能存在耐受性。Phillips等[23]將乳腺癌細胞懸浮培養(yǎng)制備乳腺球和貼壁培養(yǎng),2種培養(yǎng)來源的細胞均制備成單細胞懸液,經(jīng)2 Gy劑量放射線照射后,結果顯示乳腺球來源的細胞具有更強的抗輻射性,兩者經(jīng)照射后中位存活率相差近20％。同時Phillips等體外研究還表明,MCF-7細胞經(jīng)放療后乳腺癌干細胞的比例由3.5％增加到7.5％(P=0.009)。檢測與放射敏感性相關分子,如活性氧水平、組蛋白H2AX磷酸化等,乳腺球來源細胞這2種物質(zhì)均減少。分次照射后,非黏附性CD44+CD24-細胞在單細胞懸液中比例增加,提示這類細胞相對于其他細胞具有更強抗輻射能力。Woodward等[24]將Wnt1轉基因小鼠來源的乳腺細胞和β-catenin轉染的乳腺細胞經(jīng)放射線照射后發(fā)現(xiàn)SP細胞比例增加較對照組更明顯,且射線照射后激活的β-catenin在Lin-CD29hCD24+表型細胞中選擇性高表達,提示W(wǎng)nt1和β-catenin可能調(diào)控乳腺干細胞的抗輻射能力。這些實驗結果證實了一直以來人們的1種推測,即腫瘤干細胞對放療具有抵抗性。但是這些研究還只是停留在體外實驗上,體內(nèi)的結果還有待進一步驗證。

3.3 乳腺癌干細胞與內(nèi)分泌治療

對于雌激素受體陽性的乳腺癌患者,內(nèi)分泌治療是十分重要的治療方法。因此,雌激素及各種抗雌激素藥物對激素受體陽性乳腺癌中腫瘤干細胞的影響至關重要,其最終可能決定著乳腺癌內(nèi)分泌治療的成敗。許健等[25]應用ER陽性的乳腺癌細胞系MCF-7來研究雌二醇(E2)及拮抗劑他莫西芬( tamoxifen,TAM)對其中腫瘤干細胞相關亞群(CD44+CD24-/low細胞)含量的影響,從腫瘤干細胞的角度來探討乳腺癌內(nèi)分泌治療的作用，從而得出不同濃度E2作用下,MCF-7中腫瘤干細胞相關亞群含量增加,而在相同濃度的E2作用下,添加抗雌激素藥物TAM能夠使MCF-7中腫瘤干細胞相關亞群含量降低。對于激素受體陽性的乳腺癌患者,內(nèi)分泌治療具有很好的療效。但是,內(nèi)分泌治療的作用機制十分復雜,很多尚處于探索階段。

總之，乳腺癌干細胞理論為根治乳腺癌開辟了新的治療途徑，腫瘤治療研究開始以特異性乳腺癌干細胞為主要目標，即從源頭上根治腫瘤。發(fā)現(xiàn)和闡明乳腺癌干細胞的本身的特性，將為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的靶點，針對乳腺癌干細胞的新一代特異性強的抗腫瘤生物及免疫藥物有望極大地提高腫瘤的治療效果。但到目前為止,腫瘤干細胞研究剛剛起步,仍存在諸多問題,科研工作者們也面臨著更多的挑戰(zhàn)。

[1]Dalerba P,Cho RW,Clarke MF.Cancer stem cells:models and concepts〔J〕.Annu Rev Med,2007,58(6):267.

[2]Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983.

[3]Ponti D,Costa A,Zafaroni N,et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem /progenitor cell properties〔J〕.Cancer Res,2005,65(13):5506.

[4]Gabriella H,Bendahl PO,Ringner M,et al.The CD44+ /CD24-phenotype is enriched in basaike breast tumors〔J〕.Breast Cancer Res,2008,10(3):R53.

[5]Danuta B.Moving forward in human mammary stem cell biology and breast cancer prognostication using ALDH1〔J〕.Cell Stem Cell,2007,1(5):485.

[6]Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome〔J〕.Cell Stem Cell,2007,1(5):555.

[7]Charafe-Jauffret E,Ginestier C,Iovino F,et al.Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature〔J〕.Cancer Res,2009,69( 4):1302.

[8]Jelski W,Chrostek L,Szmitkowski M,et al.The activity of class I,II,III,and IV of alcohol dehydrogenase isoenzymes and aldehydedehy dr ogenase in pancreatic cancer〔J〕.Pancreas,2007,35(2):142.

[9]Minegishi Y,Tsukino H,Muto M,et al.Suscep tibility to lung canc er and genetic polymorphisms in the alcohol metabo literelateden zymes alcohol dehydrogenase 3,aldehyde dehydrogenase 2,and cytochrome P450 2E1 in the Japanese population〔J〕.Cancer,2007,110(2):353.

[10]Patrawala L,Calhoun T,Schneider-Broussard R,et al.Side population is enriched in tumorigenic,stem-like cancer cells,where as ABCG2+ and ABCG2-cancer cells are similarly tumorigenic〔J〕.Cancer Res,2005,65(14):6207.

[11]Engelmann K,Shen HM,Finn OJ.MCF-7 side population cells with characteristics of cancer stem /progenitor cells express the tumor Antigen MUC1〔J〕.Cancer Res,2008,68(7):2419.

[12]Zhang J,Niu C,Ye L,et al.Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size〔J〕.Nature,2003,425(6960):836.

[13]Sheridan C,Kishimoto H,Fuchs RK,et al.CD44 + /CD24 - breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties an early step necessary form etastasis〔J〕.Breast Cancer Res,2006,8(5):R59.

[14]Mumcuoglu M,Bagislar S,Yuzugullu H,et al.The ability to generate senescent progeny as a mechanism underlying breast cancer cell heterogeneity〔J〕,PLoS One，2010,5(6):e11288.

[15]Balic M,Lin1 H,Young L,et al.Most early dissem inated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype〔J〕.Clin Cancer Res,2006,12(19):5615.

[16]Shipitsin M,Lauren L,Polyak K,et al.Molecular definition ofbreast tumor heterogeneity〔J〕.Cancer Cell,2007,11(3):259.

[17]Mylona E,Giannopoulou I,Fasomytakis E,et al.The clinicopatho logic and prognostic significance of CD44+ /CD24-/low and CD44-/CD24+ tumor cells in invasive breast carcinomas〔J〕.Hum Pathol,2008,39(7):1096.

[18]Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome〔J〕.Cell Stem Cell ,2007,1(5):555.

[19]Zhou L,Jiang Y,Yan T,et al.The prognostic role of cancer stem cells in breast cancer:a meta-analysis of published literatures〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2010,122(3):795.

[20]Lindeman GJ,Visvader JE.Insights into the cell of origin in breast cancer and breast cancer stem cells〔J〕.Asia Pac J Clin Oncol，2010,6(2):89.

[21]Piyush B,Tamer T,Jiang GZ,et al.Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-through put screening〔J〕.Cell,2009,138(4):645.

[22]Huang M,Li Y,Zhang H,et al.Breast cancer stromal fibroblasts promote the generation of CD44+CD24- cells through SDF-1/CXCR4 interaction〔J〕.Exp Clin Cancer Res,2010,29(1):80.

[23]Phillips TM,McBride WH,Pajonk F.The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation〔J〕.J Natl Cancer Inst,2006,98(24):1777.

[24]Woodward WA,Chen MS,Behbod F,et al.WNT/beta-catenin mediates radiation resistance of mouse mammary progenitor cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(2):618.

[25]許 健,王 水,許立生,等.雌激素對MCF-7中腫瘤干細胞相關亞群影響的實驗研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2007,14(9):650.