蔣建春，張海添

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

EMSY基因定位于染色體11q13.5，其編碼一種抑制性蛋白?，F(xiàn)已證實(shí)，基因啟動(dòng)子CpG島區(qū)DNA發(fā)生異常甲基化可能引起腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)［1］。李云青等［2］發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1基因出現(xiàn)異常甲基化。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)散發(fā)性乳腺癌組織中EMSY基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，進(jìn)一步探討異常甲基化狀態(tài)與散發(fā)性乳腺癌發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2009年3月～2010年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的散發(fā)性乳腺癌66例，均為女性，年齡30～72歲;無(wú)乳腺癌家族史。均行手術(shù)治療，留取腫瘤組織，同時(shí)留取距腫瘤邊緣＞5cm的良性乳腺組織32例。收集標(biāo)本快速置入液氮過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入－80℃低溫冰箱儲(chǔ)存。

1.2 受檢標(biāo)本DNA提取與修飾 取冰凍的乳腺組織標(biāo)本，解凍后取約0.5 g，剪碎研磨置1.5 ml離心管中，加 0.5 ml的 TES，50 μl的 SDS(10%)，5.5 μl的蛋白酶K(20 mg/ml)，充分混勻后置56℃水浴中5 h。用酚—氯仿法抽提DNA，用2.5倍的冰無(wú)水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗滌后溶于100 μl滅菌水中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其純度及濃度，－20℃儲(chǔ)存。參照Herman方法修飾DNA。取3 μg的DNA加入總體積 50 ml的滅菌水中，加入 5.5 μl的NaOH(3 mol/L)，37℃水浴 20min，加入新鮮配制的氫醌30 μl(10 mmol/L)與 520 μl的亞硫酸氫鈉(pH 5.0)，混勻后加200 μl礦物油，50 ℃避光水浴16 h，用Wizard DNA clen-up system試劑盒回收純化 DNA，加入 5.5 μl的 NaOH(3 mol/L)室溫 15min，33 μl的乙酸銨(10 mol/L)中和 NaOH 后，用并無(wú)水乙醇沉淀DNA。將修飾后的DNA溶于30 μl滅菌水中，－20℃保存。

1.3 EMSY基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)檢測(cè) EMSY基因啟動(dòng)子甲基化與非甲基化引物由PCR引物設(shè)計(jì)軟件 MethPrimer在線設(shè)計(jì)，甲基化引物 5'-ATTTCGTAATTCGTAAATCGGTTAC-3'(上游)，5'-ACTTTATTCCTAAAATACCGTCGAA-3'(下游)，目的片段長(zhǎng)度173 bp;非甲基化引物5'-TTTTGTAATTTGTAAATTGGTTATGG-3'(上 游)，5'-ACTTTATTCCTAAAATACCATCAAA-3'(下游)，目的片段長(zhǎng)度為172 bp。PCR體系為25 μl，含有修飾后的 DNA 3 μl、10 × buffer 2.5 μl、2.5 mmol/L 的 dNTP 2 μl、hotstartaq酶 1 U、上下游引物各 0.5 μl，去離子水補(bǔ)齊至25 μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，95℃ 30 s，63 ℃(M)或 59 ℃(U)45 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠90 V電壓電泳40min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)比較用四格表資料的χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，得到EMSY啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)物(173 bp)和非甲基化產(chǎn)物(172 bp)。66例散發(fā)性乳腺癌組織中有11例(16.7%)出現(xiàn)甲基化(包括完全甲基化不完全甲基化)產(chǎn)物條帶，32例癌旁良性組織中有12例(37.5%)出現(xiàn)甲基化產(chǎn)物條帶;兩者相比，P ＜0.05。

3 討論

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一。甲基化是指在DNA甲基化酶的作用下將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上。DNA甲基化在細(xì)胞功能、基因的表達(dá)和染色體的穩(wěn)定中起重要作用［3］。DNA甲基化不是改變基因的序列而是影響基因的表達(dá)，所以異常的甲基化狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已有研究［4］發(fā)現(xiàn)，在癌組織基因中常會(huì)出現(xiàn)高甲基化或低甲基化狀態(tài)，異常的甲基化可能會(huì)引起相關(guān)基因表達(dá)異常。高甲基化可引起抑癌基因的表達(dá)缺失，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［5］，可能與甲基化抑制某些非必需基因的表達(dá)使其處于沉默狀態(tài)有關(guān)，如RASSF1A在乳腺癌中呈高甲基化［2］。但也有研究［6］表明，DNA低甲基化比高甲基化在腫瘤中更為常見(jiàn)，低甲基化使基因突變率升高，基因的雜合丟失還與低甲基化致使基因激活有關(guān)。這些變化可能改變了基因的穩(wěn)定性，引起基因表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞表型的改變和腫瘤的發(fā)生。DNA甲基化異常多發(fā)生在腫瘤的早期階段，所以，對(duì)相關(guān)基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)可能為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)。

EMSY基因被公認(rèn)為是一種致癌基因［7］，其過(guò)表達(dá)可引起B(yǎng)RCA2基因3號(hào)外顯子表達(dá)缺陷而引發(fā)腫瘤［8］。已有研究發(fā)現(xiàn)，EMSY基因在13%散發(fā)性乳腺腫瘤中過(guò)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性乳腺癌中EMSY基因啟動(dòng)子呈低甲基化狀態(tài)，這可能為散發(fā)性乳腺癌早期診斷提供了一個(gè)新依據(jù)，也有助于推動(dòng)乳腺癌基因治療和預(yù)后判斷的研究，而 EMSY基因啟動(dòng)子低甲基化與其基因過(guò)表達(dá)是否有關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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