顧立學(xué)，羅俊生，王 瑞，馮 旭，關(guān) 寧，霍曉川

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

缺血性腦血管病(ICVD)的主要病理基礎(chǔ)是腦供血血管的動(dòng)脈粥樣硬化(AS)性狹窄［1］。AS斑塊的顯著特征是脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞中蓄積形成泡沫細(xì)胞［2］。如何抑制AS的形成及發(fā)展是防治ICVD的重要研究方向。人膽固醇酯水解酶(hCEH)主要作用是催化膽固醇酯(CEs)水解為游離膽固醇(FC)，從而促進(jìn)膽固醇外流，減少CEs在細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而減少泡沫細(xì)胞形成。研究發(fā)現(xiàn)hCEH的表達(dá)水平與AS的易感性呈負(fù)相關(guān)［3］?？梢?jiàn)，hCEH在AS的形成過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。2009年12月～2010年10月，我們構(gòu)建了hCEH綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1-hCEH，通過(guò)轉(zhuǎn)染單核巨噬細(xì)胞，可以特異性上調(diào)其pEGFP-N1-hCEH表達(dá)，為進(jìn)一步研究hCEH的功能奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人肝細(xì)胞L-O2(北京酶阿查生物控股有限公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，E.coli DH5α、pMD19-T 克隆載體試劑盒、限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和 SalⅠ、RNA PCR Kit ver.3.0 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)，凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Axygenbio公司)，F(xiàn)UGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(羅氏公司)。真核表達(dá)載體pEGFP-N1、人單核巨噬細(xì)胞株U937(遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的hCEH基因［AC:AY268104編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物(由大連TakaRa公司合成)］。上游引物序列:5＇-GTCAGAATTCACCATGTGGCTCCGTGCCTTTATC-3＇(內(nèi)含EcoRI位點(diǎn)GAATTC、Kozac序列ACC和起始密碼子 ATG;下游引物序列:5＇-TGTAGTCGACCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3＇(內(nèi)含 SalⅠ位點(diǎn)GTCGAC，為實(shí)現(xiàn)基因與表達(dá)載體的融合表達(dá)，終止密碼子由TGA突變?yōu)門(mén)GG)。

采用Trizol一步法從L-O2中提取總RNA。測(cè)定濃度，并根據(jù)A260/A280分析RNA樣品純度。10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品的完整性。用提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR，反應(yīng)產(chǎn)物回收、純化后，取5 μl用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 T-A克隆及pEGFP-N1-hCEH的構(gòu)建 ①T載體連接及測(cè)序:將回收純化的 PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，命名為pMD19-T-hCEH，并將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑現(xiàn)象，選取白色菌落進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。用Axyprep質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和 SalⅠ雙酶切鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送大連TakaRa公司測(cè)序。②pEGFPN1-hCEH的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和 SalⅠ分別切割pEGFP-N1和pMD19-T-hCEH，37℃過(guò)夜。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收純化。T4連接酶將酶切回收的pEGFP-N1和hCEH連接，22℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-hCEH，送大連TakaRa公司測(cè)序。

1.2.3 U937培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染 取在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的U937，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1 d將U937接種于6孔板內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80% ～90%后，按照FUGENE HD轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染組)。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1對(duì)照組(對(duì)照組)和未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞組(正常組)。轉(zhuǎn)染72 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)情況，96 h后加G418(500 μg/ml)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞篩選，挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用G418(250 μg/ml)維持培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 L-O2中總RNA的提取及hCEH基因獲取結(jié)果 1%瓊脂糖凝膠電泳條帶顯示28 S、18 S和5 S蛋白條帶，28 S是18 S的兩倍，條帶清晰，提示總RNA提取完整。PCR擴(kuò)增后獲得約1700 bp的蛋白條帶，與hCEH基因(1704 bp)基本一致。條帶清晰、特異(說(shuō)明T-A克隆成功)。

2.2 pEGFP-N1-hCEH的構(gòu)建及鑒定結(jié)果pMD19-T-hCEH重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后，回收目的片段亞克隆至表達(dá)載體 pEGFP-N1(4700 bp)，轉(zhuǎn)化后提取的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，獲得2條與hCEH編碼基因片段及pEGFP-N1載體相對(duì)應(yīng)的條帶(1700、4700 bp)。

測(cè)序結(jié)果證明擴(kuò)增的目的片段與GenBank中hCEH的基因序列完全一致。該基因序列用Primer5.0翻譯成氨基酸序列后，與GenBank中的氨基酸序列完全相同，說(shuō)明pEGFP-N1-hCEH構(gòu)建成功。

2.3 pEGFP-N1-hCEH 轉(zhuǎn)染 U937后 pEGFP-N1-hCEH的表達(dá) 轉(zhuǎn)染組48 h后，部分細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，但熒光微弱，96 h后熒光細(xì)胞數(shù)目最多，熒光最強(qiáng)。G418篩選到14 d，出現(xiàn)細(xì)胞的單克隆團(tuán)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)出綠色熒光較弱。對(duì)照組48 h后，熒光相對(duì)較強(qiáng)，隨后熒光細(xì)胞數(shù)目增多，96 h后熒光明顯增強(qiáng)。G418篩選14 d后出現(xiàn)單克隆團(tuán)，熒光較強(qiáng)。正常組無(wú)熒光表達(dá)。

3 討論

CEs在巨噬細(xì)胞內(nèi)蓄積是AS發(fā)展過(guò)程中最早發(fā)生的普遍事件之一［4］。CEs與脂蛋白質(zhì)一起在內(nèi)含體或溶酶體內(nèi)被水解為FC，后者轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集到血漿膜。過(guò)量的膜膽固醇和部分低密度脂蛋白(LDL)衍生的FC被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被脂酰輔酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(ACAT1)重新酯化，儲(chǔ)存在胞質(zhì)脂質(zhì)小滴中［5］。導(dǎo)致CEs在細(xì)胞內(nèi)蓄積，泡沫細(xì)胞形成。細(xì)胞外受體介導(dǎo)的膽固醇外流是去除細(xì)胞內(nèi)膽固醇的主要機(jī)制，對(duì)防止泡沫細(xì)胞的形成和AS病變的發(fā)展起關(guān)鍵作用［6］。然而，為了使其能外流，F(xiàn)C首先必須通過(guò)中性CEH介導(dǎo)的水解作用從儲(chǔ)存的CEs中釋放出來(lái)［7］。

本實(shí)驗(yàn)以GenBank公布的hCEH的編碼序列為模板設(shè)計(jì)引物，提取L-O2中總RNA，經(jīng)TR-PCR擴(kuò)增獲取目的基因，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFPN1-hCEH，通過(guò)酶切鑒定、菌液PCR和DNA序列測(cè)定證實(shí):獲取的片段為hCEH目的基因，pEGFP-N1-hCEH構(gòu)建成功。并進(jìn)一步將pEGFP-N1-hCEH轉(zhuǎn)染U937，轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，證明hCEH在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)CEH的表達(dá)水平與AS的易感性呈負(fù)相關(guān)，AS斑塊的消退與膽固醇逆行轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞內(nèi)的FC通過(guò)細(xì)胞外膽固醇受體被傳送到肝臟轉(zhuǎn)變成膽汁膽固醇和膽汁酸最終被清除，這種FC從巨噬細(xì)胞定向轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟的過(guò)程被稱為RCT，是膽固醇向體外代謝的主要途徑［8］，而CEH介導(dǎo)的水解作用是RCT中的限速步驟［9］。近期研究表明，CEH在肝臟內(nèi)的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)膽固醇逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)體內(nèi)膽固醇的清除。因此，CEH在AS的形成過(guò)程中可能起到關(guān)鍵性的作用。pEGFPN1-hCEH的成功構(gòu)建，為hCEH與AS相關(guān)性的研究提供工具。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U937模型的建立，對(duì)研究hCEH對(duì)膽固醇代謝機(jī)理的研究具有重要意義。

［1］Dahl A，Lund C，Russell D.Atherosclerosis and cerebral infarction［J］.Tidsskr Nor Laegeforen，2007，127(7):892-896.

［2］de Boer OJ，van der Wal AC，Becker AE.Atherosclerosis，inflammation，and infection［J］.J Pathol，2000，190(3):237-243.

［3］Arnold E.Cholesterol efflux from macrophages and other cells［J］.Curr Opin Lipidol，1996，7(5):308-319.

［4］Zhao B，Song J，Chow WN，et al.Macrophage-specific transgenic expression of cholesteryl ester hydrolase significantly reduces atherosclerosis and lesion necrosis in Ldlr mice［J］.J Clin Invest，2007，117(10):2983-2992.

［5］Yagyu H，Kitamine T，Osuga J，et al.Absence of ACAT-1 attenuates atherosclerosis but causes dry eye and cutaneous xanthomatosis in mice with congenital hyperlipidemia［J］.J Biol Chem，2000，275(28):21324-21330.

［6］Accad M，Smith SJ，Newland DL，et al.Massive xanthomatosis and altered composition of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice lacking acyl CoA:choleaterol acyltransferase 1［J］.J Clin Invest，2000，105(6):711-719.

［7］Dove DE，Su YR，Zhang W，et al.ACAT1 deficiency disrupts cholesterol efflux and alters cellular morphology in macrophages［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(1):128-134.

［8］Patricia G，Yancey，Anna E，et al.Importance of different pathways of cellular cholesterol efflux［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(4):712-719.

［9］Rothblat GH，de la Llera-Moya M，F(xiàn)avari E，et al.Cellular cholesterol flux studies:methodological considerations［J］.Atherosclerosis，2002，163(7):1-8.