余果宇， 張 勇， 張 云 (中國科學(xué)院昆明動物研究所動物模型與人類疾病機制重點實驗室， 昆明6503;昆明醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室;通訊作者，Tel:087 －59855，E-mail:zhangy@mail.kiz.ac.cn)

三葉因子的研究進展

余果宇1，2， 張 勇1， 張 云1*(1中國科學(xué)院昆明動物研究所動物模型與人類疾病機制重點實驗室， 昆明650223;2昆明醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室;*通訊作者，Tel:0871 －5198515，E-mail:zhangy@mail.kiz.ac.cn)

三葉因子; 組織分布; 黏膜修復(fù); 腫瘤

三葉因子(trefoil factor，TFFs)是一類含一個或幾個三葉因子結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白，該結(jié)構(gòu)域是一段38或39個氨基酸的多肽，其中的6個半胱氨基以1－5，2－4，3－6配對的構(gòu)型方式生成三對二硫鍵，從而形成典型的三葉狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)賦予TFFs家族蛋白耐酸、耐堿和耐蛋白酶水解的性質(zhì)，同時也是其行使功能所必需的。人TFFs包括含一個三葉因子結(jié)構(gòu)域，與乳腺癌相關(guān)的多肽(TFF1或PS2)和小腸三葉因子(TFF3或ITF)以及含兩個結(jié)構(gòu)域的解痙攣多肽(SP或TFF2)。TFFs在黏膜防御、修復(fù)、再生等過程中發(fā)揮著重要作用，并且其表達的異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。下面就TFFs的組織分布、黏膜修復(fù)功能以及與腫瘤的關(guān)系作一綜述。

1 三葉因子的組織分布

胃腸道是TFFs的主要合成部位，TFF1主要表達在胃黏膜表面，TFF2主要分布在胃竇頸區(qū)，幽門黏膜區(qū)底部和十二指腸Brunner’s腺體中，即分布在從基底部到中間的位置，其分布正好和TFF1互補。TFF3主要表達在成熟杯狀細胞中并被分泌到腸黏膜表面［1］。而在其他組織的黏膜上皮，如唾液腺、角膜、結(jié)膜、淚腺導(dǎo)管、喉部、子宮頸內(nèi)膜、淋巴組織、下丘腦和垂體等也有TFFs的表達，其表達量的改變常相關(guān)于臨床疾病的發(fā)生。

2 三葉因子的組織修復(fù)功能

胃腸道黏膜的正常修復(fù)依賴基底膜上皮細胞的迅速遷移，這需要黏膜分泌很多物質(zhì)，而TFFs是最關(guān)鍵的。在胃黏膜受損時，TFFs以自分泌的方式持久性地迅速合成、分泌和分配。體外模型中，TFFs參與不同階段的愈合過程，在調(diào)節(jié)細胞免疫、促進黏膜再生與修復(fù)、調(diào)節(jié)細胞間連接和促進細胞遷移等方面都發(fā)揮了重要作用，所以TFFs被稱為腔內(nèi)監(jiān)督肽。

2.1 三葉因子在免疫反應(yīng)中的作用 TFFs能促進炎癥的發(fā)生，認為可能與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。表皮受損后，TFFs表達增加并且刺激細胞遷移以促進短期愈合和長期上皮再生，并通過增強黏液屏障來減少受損表皮的抗原反應(yīng)。在TFFs基因敲除的老鼠中，TFF1缺陷者形成幽門腺瘤和癌，TFF3敲除者由于腸細胞的凋亡而增強其對損傷的敏感性;TFF2缺陷者表現(xiàn)出胃黏膜的增厚，黏液頸細胞數(shù)目、胃腺高度和胃黏膜增殖率降低［2］。在胃幽門和Brunner’s腺體中，TFF2的缺陷還能使TFF3的表達增加40倍，而對TFF1缺陷的老鼠，TFF2的敲除并不改變TFF3在胃中的表達，提示TFF2對TFF3表達的影響依賴于TFF1。TFFs表達在脾、胸腺、淋巴結(jié)和骨髓的事實也提示它們參與免疫反應(yīng)，而TFFs被用來治療潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病以及感染性腸病源于TFFs能引起單核細胞的遷移。TFF2也能減輕腸炎模型中的炎癥和潰瘍的發(fā)生。TFF3則通過NF-кB增強衰變加速因子基因啟動子的活性和mRNA的穩(wěn)定性以促進其表達，從而阻止腸上皮細胞補體的激活和沉積以減輕免疫反應(yīng)。

2.2 三葉因子促進黏膜的再生與修復(fù) 黏膜受損時，通過增殖和分化完成再生的過程過于緩慢。因此，鄰近細胞遷移到受傷部位建立緊密的黏膜屏障來阻止廣泛感染的發(fā)生是上皮迅速修復(fù)所必需的。這一基礎(chǔ)修復(fù)過程因無細胞增殖和蛋白質(zhì)合成，所以幾分鐘內(nèi)即可完成，但黏膜需要能量依賴性地持續(xù)血供，而糖酵解就為這種早期的細胞遷移過程提供能量，同時也為細胞的極化和緊密連接的形成，即形態(tài)的修復(fù)提供能量。而黏膜屏障的完全恢復(fù)則依賴于線粒體的有氧氧化［3］。在胃腸道受損時，TFF2的表達迅速升高，它通過抑制胃酸的分泌和刺激黏膜細胞增殖來發(fā)揮促黏膜修復(fù)功能，并通過與特異性受體的結(jié)合來調(diào)節(jié)此功能［2］。TFF3能激活HT-29中表皮生長因子受體(EGFR)并磷酸化β連環(huán)蛋白，而在另一些細胞系中，TFF3則依賴EGFR反式激活和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的方式阻止細胞凋亡［4］。

2.3 三葉因子調(diào)節(jié)細胞間連接 TFFs能降低細胞間以及細胞與基質(zhì)的相互作用以增強細胞間的分散。TFF1和TFF3的過表達誘導(dǎo)細胞在膠原中分散性地生長，TFF2也誘導(dǎo)細胞由致密型生長方式轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚⑿?。事實上，TFFs通過降低E－鈣黏素、α－連環(huán)蛋白和β－連環(huán)蛋白的表達來調(diào)節(jié)細胞的黏著連接，從而增強細胞間的分散度。TFFs作用的另一個結(jié)果是蛋白激酶的磷酸化。由TFF3引起的β－連環(huán)蛋白的磷酸化是E－鈣黏素/連環(huán)蛋白復(fù)合物的酪氨酸發(fā)生磷酸化的基礎(chǔ)。

2.4 三葉因子促進細胞遷移 細胞發(fā)生遷移需要破壞細胞間以及細胞與基質(zhì)之間的連接，而這種連接的喪失會引發(fā)細胞凋亡。TFFs在沒有促進細胞增殖、腫瘤形成或破壞其相互作用的情況下，成為維持上皮再生所必需的唯一一類蛋白家族，但其作用機制目前仍不清楚。TFF1和TFF2表達在腺上皮的柱狀細胞中，以自分泌的方式發(fā)揮作用;TFF3表達在杯狀細胞，以一種旁分泌的方式作用于鄰近腸細胞。體外受損模型中，TFF2和TFF3能引起受損上皮細胞以3－6倍的速率遷移到受損區(qū)域，而對正常腸細胞則無促細胞遷移活性。

3 三葉因子與腫瘤的發(fā)生

TFFs是促進還是抑制腫瘤的形成，迄今為止仍有很多爭議。但TFFs的異常表達出現(xiàn)在多種實體瘤中，TFFs是分泌性蛋白，所以用免疫組化，或者定量分析組織或細胞中的蛋白含量都不能用來作為預(yù)測患者病理程度或評判其預(yù)后的最佳指標。相反，分泌型TFFs出現(xiàn)在外周循環(huán)中，所以血清中TFFs的水平能夠為那些依賴TFFs的腫瘤提供更有效的評判信息。

3.1 作為腫瘤抑制因子 胃黏膜的慢性感染是胃癌發(fā)生的基礎(chǔ)。受損胃黏膜中，TFF2和TFF3持續(xù)上調(diào)，TFF1則下調(diào)，這一現(xiàn)象早于組織化生形成前。胃癌中，TFF1表達喪失并伴隨等位基因的缺失，說明TFF1是一種腫瘤抑制基因，它表達的缺失源于啟動子的超甲基化。在轉(zhuǎn)化或非轉(zhuǎn)化胃腸道細胞系中過表達或引入外源性TFF1二聚體都會通過延遲G1期向S期的轉(zhuǎn)化來減弱細胞的增殖以減少細胞數(shù)目［5，6］。盡管一種異常的 TFF2 表達譜系(SPEM)是早期胃癌發(fā)生的明顯標志，但TFF2的突變在胃癌中還是很少見，僅在第二個內(nèi)含子中出現(xiàn)一個重復(fù)序列多態(tài)性，并且這種突變與胃癌的發(fā)生沒有明顯的相關(guān)性。在胃癌發(fā)生的整個過程，幽門螺旋桿菌的感染使TFF2啟動子的甲基化水平升高，而后者又可降低TFF2 mRNA及蛋白的表達水平;基因組的去甲基化則可恢復(fù)TFF2在胃癌細胞系中的表達。事實上，TFF2的表達能夠抑制胃組織的癌前病變和胃癌的進展，TFF2的缺陷則減弱胃黏膜細胞的增殖，從而降低胃黏膜的厚度、胃腔的面積和腺體的高度，但TFF2表達的改變與腸癌細胞系的增殖無關(guān)。在腸腺瘤到癌的轉(zhuǎn)變過程中，TFF3的mRNA和蛋白水平都明顯下降，并且腸癌細胞系增殖能力的減弱相關(guān)于TFF3的過表達，TFF3也可以適度減弱裸鼠體內(nèi)腫瘤的種植性生長［2，7］。

3.2 作為腫瘤促進因子 TFFs通過促進細胞增殖，保護細胞免受凋亡，刺激細胞遷移浸潤和血管生成等來促進腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，所以TFFs是癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。

3.2.1 增殖 細胞增殖是腫瘤發(fā)生的決定性因素。TFF1能增加細胞周期蛋白D1在細胞內(nèi)的含量，從而加速細胞的增殖以促進腫瘤的形成［5］。在腸癌和乳腺癌細胞系中，TFF2通過促進細胞周期的進程來使細胞增殖，而重組TFF2在濃度大于10 mg/ml時也具有明顯的促胃腺癌MKN-28細胞增殖的效應(yīng)［8］。但也有研究表明，與TGF-α和β不同，TFF2和TFF3通過促進細胞遷移來幫助傷口愈合，而不是通過調(diào)節(jié)上皮細胞的增殖發(fā)揮作用。TFF3的自分泌性表達也可以增強乳腺癌細胞系的增殖，而反義分子消除TFF3的表達后又可以減弱胃癌細胞系的倍增時間［9］。

3.2.2 凋亡 凋亡過程的抑制也是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。TFFs通過抑制細胞遷移過程中的凋亡來促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在修復(fù)過程中，TFFs的促動力效應(yīng)與它們的抗凋亡功能相一致。TFF1通過降低細胞凋亡蛋白酶(caspase)的活性來保護胃癌和腸癌細胞免受化學(xué)、不能貼壁或者細胞死亡引起的凋亡，從而增強它們的存活率［5］，同時TFF1也能保護胃癌細胞免受拓撲異構(gòu)酶抑制劑依托泊苷引起的凋亡［9］。TFF2的過表達能對抗胃癌細胞的凋亡并且與抑癌基因P53密切相關(guān)，P53通過作用激活蛋白1(AP-1)相似位點下調(diào)TFF2的表達，從而引發(fā)細胞凋亡和抑制細胞遷移，提示TFF2可能是P53下游的重要目的蛋白［10］。同樣TFF2也能抑制無TFF2表達的乳腺癌細胞系MCF-7的凋亡，而對那些表達TFF2的細胞系則無這種細胞保護效應(yīng)。TFF3的凋亡效應(yīng)依賴于其完整的二聚體形式，并且通過激活EGFR和PI3K通路來磷酸化Akt以發(fā)揮效應(yīng)。也有研究認為TFF3通過PI3K/Akt/核因子κB(NF-κB)來抑制與錨定蛋白相關(guān)的凋亡，激活的NF-κB同時調(diào)節(jié)NOS-2和環(huán)氧化酶2(COX-2)基因的表達以調(diào)節(jié)細胞的凋亡［11］。在腸癌細胞系中，自分泌的TFF3以依賴PI3K的方式對抗無血清和C2神經(jīng)酰胺引發(fā)的凋亡，同時通過激活A(yù)kt蛋白激酶B的方式來增強乳腺癌細胞系的存活。

3.2.3 遷移和浸潤 細胞遷移和浸潤是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。在正常和腫瘤細胞中，TFFs都具有潛在的促細胞運動功能，而且這一活性常依賴于ERK1/2磷酸化的增強以及PKC的激活。自分泌的TFF1足以引起腸癌細胞發(fā)生持續(xù)性地浸潤，同時也是乳腺癌細胞的潛在化學(xué)趨化物。TFF1通過PI3K依賴的方式促進胃癌細胞遷移和浸潤［6］。TFF2在正常和惡性乳腺上皮細胞中都有表達，這種表達與雌激素受體的存在與否無關(guān)，并且TFF2能促進乳腺癌細胞的遷移。在浸潤型胃腫瘤細胞，彌漫型或有淋巴結(jié)和血道轉(zhuǎn)移的胃癌組織中TFF2都是高表達。表達TFF2的腫瘤患者的預(yù)后也較不表達者為差，提示TFF2在胃癌的浸潤中發(fā)揮了重要功能，并可能作為一種有用的目的蛋白來干預(yù)治療［12］。TFF3也能通過調(diào)節(jié)E－鈣黏著蛋白—連環(huán)蛋白復(fù)合物的功能促進腸癌細胞的遷移和浸潤［13］。

3.2.4 血管生成 新生血管的生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移所必需的條件。無論在體內(nèi)還是體外，TFFs都作為血管生成因子促進血管生成。TFF1誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)既依賴于COX-2，又依賴于EGFR。而TFF3是通過誘導(dǎo)一氧化氮(NO)合成酶來刺激NO的生成，而NO是腫瘤血管生成的一種重要內(nèi)皮生成因子，胃癌發(fā)生中腫瘤血管的生成也與TFF3表達的增強相伴而行［14］。

總之，TFFs是一類分布廣泛，在生物體內(nèi)具有重要生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)因子，它們的生理病理功能與組織再生修復(fù)、細胞遷移、增殖分化乃至腫瘤的發(fā)生發(fā)展等功能密切相關(guān)，這也使其可能作為炎癥發(fā)生的調(diào)節(jié)子、抑癌基因或癌基因來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。所以不容置疑的是，隨著對TFFs生物學(xué)功能研究的深入，將使它們在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到越來越廣泛的運用。

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10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.024

973項目(2010CB529805);國家基金委重點項目(30630014);國家基金委面上項目(30570359);中國科學(xué)院重要方向項目(KSCX2-YW-R-088)

余果宇，女，1972－05生，博士，副教授，E-mail:yuguoyu725@163.com.

2010－11－04］