李曉蕾，李景富，許向陽

（東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是茄科（Solanaceae）番茄屬（Lycopersicon）的一年生或多年生植物，原產于南美西部高原地帶。隨著市場的擴展和消費者的增多，人們對番茄品質的要求也越來越高。1994年美國Calgene公司開發(fā)了轉基因番茄“Flar Savr”，這是首次商業(yè)化應用的改良轉基因食品，這種番茄能夠在貨架上擺放2周以上不變軟[1]。2002年，Vrebalov等發(fā)現(xiàn)番茄中的1個MADS-box基因與果實的成熟密切相關[2]。在百合中，轉LfMASD1反基因植株中1朵花的雄蕊極短、花藥缺失；轉LfMASD1正義基因植株中發(fā)現(xiàn)1個花萼變瓣的突變體。在轉LfMASD3反義基因植株中發(fā)現(xiàn)1個植株的苞葉部分瓣化，花柄變短[3]。含遲熟基因的品種外觀表現(xiàn)為大花萼，而含大花萼突變體MC基因的品種外觀表現(xiàn)也是大花萼。由此可見，花萼性狀與MC基因存在重要的相關性。同時，隨著生活水平的提高，人們對于番茄的外觀品質要求日益提高，因此，通過研究MC基因培育外觀美觀的大花萼番茄品種也勢在必行。

目前，用于標記基因的分子標記主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP。擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragments length polymorphism，AFLP），由 Zabeau和Vos于1993年發(fā)明[4]，它實際上是RFLP和RAPD兩項技術的結合[5]。該技術同時具備了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術高效性的特點，多態(tài)性強，試驗結果穩(wěn)定，重復性好，典型的孟德爾遺傳方式。然而，它所顯示的只是擴增片段的有與無，是顯性標記。Wang等利用AFLP技術構建了甜瓜(Cucumis melo L.)的遺傳連鎖圖，含有197個AFLP位點、6個RAPD位點與1個微衛(wèi)星位點，覆蓋了1 942 cM遺傳距離，并發(fā)現(xiàn)AFLP標記在甜瓜圖譜構建中比RAPD及SSR標記更有效[6]。田雷等隨機選擇了30個AFLP的3+3引物組合進行選擇性擴增，獲得清晰可見的DNA指紋圖譜[7]。張增翠等對不結球白菜優(yōu)質品種矮抗6號及其父母本進行了AFLP標記分析，篩選出兩對AFLP引物組合，能清楚表明雜種一代與父母本之間的遺傳關系[8]。

本試驗主要研究了與番茄外觀品質密切相關的花萼性狀，采用AFLP分子標記方法在DNA水平上研究番茄大花萼基因，建立番茄AFLP分子標記技術體系，構建與番茄MC基因緊密連鎖的AFLP標記。為分子標記輔助選擇育種打下基礎，為培育番茄大花萼的品種提供理論和技術上的支持，并進一步解決了市場對大花萼番茄品種的需求問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 番茄材料

大花萼突變體親本08085、正常親本08086以及08085和08086有性雜交的F2代單株。

材料均由東北農業(yè)大學園藝學院番茄課題組提供。

1.1.2 試驗試劑

CTAB、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶、MseⅠ、EcoRⅠ、T4DNA連接酶均為BMI公司產品，Repel、Binding為北京鼎國生物技術公司生產，尿素、甲酰胺、過硫酸銨、TEMED、甲叉均為Amsensco。DNA Marker、dNTP、AFLP引物由上海生工生物工程和大連生物公司合成或生產。其他試劑如氯仿、異戊醇、異丙醇、硫代硫酸鈉、無水乙醇、甲醛、冰乙酸、甲苯青、溴化乙錠等化學試劑由哈爾濱市寶瑞生物試劑公司和哈爾濱市德美試劑公司提供。Tris-HCl、瓊脂糖為進口分裝，其他試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 田間調查

在番茄果實花期對父母本、F1及F2代群體的花萼大小進行調查并記錄。為了保證數(shù)據的穩(wěn)定性，田間數(shù)據調查先后進行3次。通過觀察后代的大花萼與正?；ㄝ鄦沃甑谋嚷剩忙?測驗法計算是否符合3∶1的分離規(guī)律。

1.2.2 基因組DNA的提取及混合池的建立

番茄幼苗四葉一心時，取番茄植株幼嫩葉片，用自來水、蒸餾水沖洗兩遍，用濾紙吸干后稱取0.2 g于1.5 mL離心管，用液氮速凍后-20℃保存?zhèn)溆?；采用CTAB微量法提取DNA[9]。

從F2代群體選取9株大花萼單株和9株正?；ㄝ鄦沃辏瑢⒋蠡ㄝ嘀晗档腄NA混合建立大花萼基因池，正?；ㄝ嘀晗礑NA混合建立正?；ㄝ嗷虺?。1.2.3 AFLP分子標記

1.2.3.1 基因組DNA的酶切與連接

基因組DNA的Eco RⅠ、MseⅠ雙酶切和接頭的連接采用一步完成，其反應體系如下：DNA 100～500 ng，Eco RⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，MseⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，Eco RⅠ adapter（5 pmol·μL-1）1.0 μL，MseⅠadapter（50 pmol·μL-1）1.0 μL，ATP（10 mmol·μL-1），10×buffer 5.0 μL，T4DNA 連接酶（5 U·μL-1）0.6 μL，加 ddH2O 調至 25 μL。37 ℃酶切與連接6～8 h或過夜（時間不能太長）。

1.2.3.2 DNA片段的預擴增

預擴增的體系：DNA（酶切連接后產物）2 μL，Eco RⅠ-primer（E00 50 ng·μL-1）0.6 μL，MseⅠ-primer（M00 50 ng·μL-1）0.6 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，MgCl21.2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加 ddH2O 調至 20 μL。

預擴增的程序：94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，24個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應。

預擴增反應在PCR儀上進行，預擴增完成后，取3 μL擴增產物和1 μL Loading buffer混合后在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后在紫外燈下檢測預擴增結果。預擴增產物稀釋20～40倍，用于選擇性擴增，余下的預擴增產物放在-20℃保存。

1.2.3.3 DNA片段的選擇性擴增

選擇性擴增的體系：DNA（預擴增產物稀釋30×）5 μL，Exx（50 ng·μL-1）1.0 μL，Mxx（50 ng·μL-1）1.0 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，MgCl21.2 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加ddH2O調至20 μL。

選擇性擴增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃30 s(每個循環(huán)-0.7℃)，72℃ 1 min，12個循環(huán)；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min（每個循環(huán)+1 s），25個循環(huán)；72℃10 min；4℃終止反應。

擴增在PCR儀上進行，選擇性擴增完成后，在擴增產物中加入30%～40%的Loading buffer在PCR儀中95℃變性5 min后，立即置于冰水混合物中冷卻，然后對擴增體系進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察統(tǒng)計條帶確定連鎖距離。

2 結果與分析

2.1 田間調查結果

結果表明，父本08085全部為大花萼，母本08086為正?；ㄝ啵現(xiàn)1代為大花萼，F(xiàn)2代群體表現(xiàn)實際分離比為 3.175∶1，χ2檢測符合 3∶1 的分離比例。分析表明，所含的MC基因所控制的性狀是由單基因控制的性狀，結果見表1。

表1 番茄MC基因遺傳規(guī)律分析Table 1 Genetic analysis of MC gene in tomato

2.2AFLP標記

2.2.1 引物篩選

利用父母本對488對引物進行初步篩選，對篩選出的61對引物進行混合池復選，得到多態(tài)性高的28對引物，結果見表2。

2.2.2 F2單株PCR擴增

以08086×08085群體的334個F2單株DNA的預擴增產物為模板，用這28對引物進行選擇性擴增。然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并記錄譜帶。對每個標記的帶型在F2群體中的分布進行χ2測驗。

表2 用于群體F2單株選擇性擴增的特異引物Table 2 Special primers used in amplication of F2individual plants of 08086×08085

利用Mapmarker 3.0軟件對該結果進行連鎖分析，結果表明，E65M63-D、E32M36-D和E47M75-A與MC基因的連鎖距離分別為5.1、7.2、12.3 cM。其中E65M63-D是有價值的分子標記，可以作為分子輔助選擇的使用，結果見圖1。

2.3 種質資源篩選

用本課題組提供的48份番茄材料為試材，進行田間調查，得到番茄大花萼材料20份，同時運用AFLP標記E65M63-D檢測，進行AFLP標記驗證分析，結果二者吻合度達91.7%，說明本試驗找到的番茄大花萼特異分子標記可以用于番茄育種材料含MC基因的追蹤選擇。圖2為部分番茄材料的AFLP標記檢測結果。

圖1 引物E65M63在部分F2單株中的擴增結果Fig.1 Amplified products on AFLP primer of E65M63 on partial F2population

圖2 E65M63-D對部分材料的檢測結果Fig.2 Amplified products of AFLP primer E65M63-D on partial individual plants

3 討論

本試驗采用了穩(wěn)定成熟的AFLP標記方法對番茄品質性狀相關的大花萼突變體MC基因進行研究，獲得了3個緊密連鎖的標記，其中標記E65M63-D遺傳距離為5.1 cM，是有價值的標記。通過對48份番茄材料進行標記檢測，并結合田間調查，二者吻合率較高，證明了所獲得的標記具有應用價值。AFLP標記的遺傳距離較遠的原因可能是與選擇的父母親本的親緣關系有關，因此在選擇上應選擇遺傳關系較遠的配制雜交組合，這樣可以獲得更多的多態(tài)性標記，有利于獲得更近的標記。

對于試驗中出現(xiàn)的偏分離現(xiàn)象在幾乎所有類型的遺傳標記都可見到[10]。分子標記表現(xiàn)偏分離的原因是由于遺傳搭車效應（Hitch hiking）和分子標記與影響偏分離等位基因頻率的遺傳因子連鎖緊密。還有另外兩種假說解釋偏分離現(xiàn)象，一種假說認為由于配子體選擇的緣故，F(xiàn)2群體出現(xiàn)偏分離的比例0∶2∶1（親本1∶正?！糜H本2）。另一種假說認為是花粉選擇導致了0∶1∶1的偏分離[11]。還有人認為偏分離現(xiàn)象是由于環(huán)境因素的影響。

本試驗的研究結果表明番茄大花萼突變體MC基因為顯性單基因控制的性狀，因此下一步的工作可將試驗獲得的標記轉化為快捷、穩(wěn)定的SCAR標記，對番茄種質資源進行準確的含MC基因資源的篩選工作。利用含MC基因的品種配制雜交組合，通過基因工程技術把相應的MC基因轉入植物的細胞中，利用細胞融合技術獲得轉基因植株，并將其應用于番茄的育種中，加速番茄品質育種進程。

4 結論

本試驗利用含MC基因的08085為父本，正常材料08086為母本，及其有性雜交的F2分離世代的種子為試驗材料。對其F2進行田間調查，調查鑒定結果表明符合3∶1的分離比率，說明MC基因是顯性單基因控制的。建立了穩(wěn)定的適合番茄基因組分析的AFLP反應的技術體系。通過篩選488對AFLP引物，利用Mapmaker 3.0軟件處理數(shù)據，最終得到3個AFLP標記與番茄大花萼MC基因連鎖，分別是E32M36-D、E65M63-D和E47M75-A，并計算得到它們與MC基因之間的遺傳距離分別為7.2、5.1、12.3 cM。應用所獲得的遺傳距離較近的AFLP標記E65M63-D對本課題組的48份番茄材料進行分析鑒定，同時結合田間鑒定，結果AFLP分析與人工接種鑒定吻合率達91.7%，進一步證明了AFLP標記的應用價值，為分子標記輔助選擇育種打下基礎。

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