李智媛，屈淑平，崔崇士

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

南瓜屬作物的種子屬于雙子葉無胚乳型種子，由種皮和胚組成。根據(jù)南瓜種子種皮的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將南瓜分為有殼南瓜種子和無殼南瓜種子，常見的南瓜為有殼南瓜，而無殼南瓜又稱裸仁南瓜，它是在有殼南瓜中發(fā)現(xiàn)的突變體，種殼在發(fā)育過程中退化為薄薄的一層膜，目前在美洲南瓜和中國南瓜中均存在無殼突變種[1－4]?？刂泼乐弈瞎下闳市誀畹幕?yàn)殡[性基因n，控制中國南瓜裸仁性狀的基因?yàn)殡[性基因n-2[5]。無殼南瓜種皮退化，種仁裸露，可以直接加工食品和食用，免去了脫皮的加工工序和加工損失，降低加工成本，出仁率高，營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)異的南瓜種質(zhì)資源[6]。鑒定和克隆南瓜裸仁基因n對于南瓜育種具有重要理論和實(shí)踐意義。

本試驗(yàn)中利用AFLP技術(shù)篩選與裸仁基因n緊密連鎖的分子標(biāo)記，為建立裸仁性狀的分子標(biāo)記輔助育種，開展裸仁南瓜育種提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及基因組DNA的準(zhǔn)備

以有殼品系“金輝二號－2”為母本，無殼品系“0516－2”為父本配制正反交組合，F(xiàn)1與無殼親本進(jìn)行回交，F(xiàn)1代自交獲得F2代種子。2008年春季，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)實(shí)習(xí)基地種植親本、F1、F2及回交世代。對F2代和回交世代進(jìn)行性狀分離調(diào)查，統(tǒng)計分離比率。父母本及各世代材料幼葉在液氮中冷凍，-80℃保存，DNA的提取采用CTAB微量法提取[7]。

1.2 AFLP反應(yīng)程序

1.2.1 酶切-連接

采用Eco RⅠ和MseⅠ對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，酶切-連接一步進(jìn)行，預(yù)擴(kuò)引物為E00和M00組合，選擇性擴(kuò)增采用E+2/M+3引物組合。在總體積25 μL的酶切-連接體系中Eco RⅠ(10 U·L-1)和MseⅠ（10 U·L-1）用量各為 0.25 μL、模板 DNA（50 ng·L-1）1 μL、Eco RⅠ接頭（5 pmol·L-1）和 MseⅠ接頭（50 pmol·L-1）各 0.5 μL、ATP （10 mmol·L-1）0.5 μL、10×Buffer 2.5 μL、T4DNA 連接酶（5 U·L-1）0.3 μL、ddH2O 19.2 μL，混勻后37℃下反應(yīng)8 h。

1.2.2 預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增體系20 μL，其組成為酶切連接產(chǎn)物5 μL、10×PCR buffer 2 μL、dNTP （10 mmol·L-1）1.6 μL、E00 引物（50 ng·L-1）0.6 μL、M00 引物（50 ng·L-1）0.6 μL、Mg2（＋25 mmol·L-1）2.5 μL、Taq酶（5 U·L-1）0.2 μL、ddH2O 8.8 μL?；靹螂x心后用以下程序擴(kuò)增：94℃3min；94℃1min，56℃1min，72℃2 min，25 cycles；72℃10 min；4℃保存。

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃保存或稀釋后用于選擇性擴(kuò)增。

1.2.3 選擇性擴(kuò)增

選擇擴(kuò)增體系20 μL，其組成為預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋 30 倍后取 5.0 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL、Mg2＋（25 mmol·L-1）1.2 μL、Eco RⅠ引物（50 ng·L-1）1.2 μL、MseⅠ引物（50 ng·L-1）1.2 μL、Taq 酶（5 U·L-1）0.25 μL、ddH2O 7.55 μL?；靹螂x心后用以下程序擴(kuò)增：94℃3 min，1 cycle；94℃30 s，65 ℃ 30 s（-0.7 ℃/cycle），72 ℃1 min，12 cycles；94℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min（+1s/cycle），30 cycles；72 ℃ 10 min。

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法進(jìn)行染色。

1.2.4 AFLP引物的選擇

根據(jù)南瓜作物的基因組大小和堿基偏好性選擇了含有2個選擇性堿基的16個Eco RⅠ引物和含3個選擇性堿基的16個MseⅠ引物配對所得的256對引物組合，對親本間擴(kuò)增條帶進(jìn)行比較。選擇親本間多態(tài)性好、條帶清晰、重復(fù)性強(qiáng)的組合再進(jìn)行復(fù)篩，篩選出20對差異性多和多態(tài)性好的引物做為F2代群體分離研究的引物組合（見表1）。

表1 用于金輝二號-2×0516-2 F2群體單株選擇性擴(kuò)增的特異引物Table 1 Primers used for amplification of F2individual plants of Jinhui2-2×0516-2

1.2.5 AFLP特異片段的克隆、測序和SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化

直接用滅菌的手術(shù)刀片從聚丙烯酰胺凝膠上割取含目標(biāo)片段的膠條，浸泡在30 μL ddH2O中，經(jīng)37℃過夜，95℃水浴煮30 min，使其充分融化，5 000 r·min-1離心 3 min。浸出液 1 μL 用作PCR擴(kuò)增模板，反應(yīng)條件參照選擇擴(kuò)增試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用大連寶生物工程有限公司膠回收試劑盒進(jìn)行，回收片段與載體選用Promaga生產(chǎn)的pGEM-T Easy vector進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，酶切驗(yàn)證正確后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

測序結(jié)果用BLAST程序進(jìn)行序列比對，根據(jù)序列結(jié)果，利用Primer 5.0設(shè)計1對SCAR引物：SCAR-E： 5′CAACATATGGAAAATCGGG 3′，SCAR-M：5′TGCGTACCAATTCGACACT 3′。以父母本、F1和F2各單株的DNA為模板進(jìn)行SCAR引物的PCR特異性鑒定和獲得SCAR標(biāo)記。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用χ2檢驗(yàn)分析各標(biāo)記是否符合分離比例、AFLP多態(tài)性標(biāo)記與田間種皮性狀的分離情況，應(yīng)用Mapmaker3.0軟件分析，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距（cM），以最大圖距50 cM作為劃分連鎖群和排列標(biāo)記的基準(zhǔn)距離。計算連鎖遺傳距離，臨界LOD值取3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 種殼性狀分離分析

F1代自交獲得193個F2代植株。通過逐一觀察植株果實(shí)種子表現(xiàn)出有殼和無殼兩種性狀，分離比例見表2。在193株F2代單株中發(fā)生性狀分離，表現(xiàn)為有殼150株，無殼43株，根據(jù)χ2測驗(yàn)χ2c＜χ2(0.05，1)=3.84，差異不顯著，表明南瓜種皮性狀在0.05水平上符合3∶1分離比，即南瓜種皮性狀符合一對等位基因的表型分離比例。回交共獲得100個植株，逐一觀察果實(shí)內(nèi)種子，其植株間同樣出現(xiàn)了無殼與有殼兩種性狀，分離比例見表3。對表3結(jié)果同樣進(jìn)行 χ2c檢驗(yàn)，計算出 χ2c=2.89，而 χ2(0.05，1)=3.84，χ2c＜ χ2(0.05，1)，檢驗(yàn)未達(dá)顯著水平，表明回交后代種皮性狀分離符合1∶1比例。經(jīng)以上自交、回交代結(jié)果分析表明，無種殼美洲南瓜種皮性狀F2代分離符合孟德爾分離規(guī)律，可以確認(rèn)無種殼（裸仁）性狀是受一對隱性核基因 (nn)所控制，而且獨(dú)立遺傳，當(dāng)隱性基因?yàn)橥|(zhì)時，種殼性狀表現(xiàn)為無殼（裸仁）。

表2 F2代群體種皮性狀分離統(tǒng)計Table 2 Segregation ratio of testa trait in F2populations

表3 回交世代種皮性狀分離統(tǒng)計Table 3 Segregation ratio of testa trait in backcross populations

2.2 AFLP引物篩選及F2單株P(guān)CR

用256對選擇性擴(kuò)增引物對親本金輝二號－2和0516－2進(jìn)行篩選，篩出差異引物94對，篩出率36.72%，每對引物擴(kuò)增出70～100條譜帶。用基因池進(jìn)行復(fù)篩，篩出20對差異性多和多態(tài)性好的引物。利用復(fù)篩得到的20對引物對金輝二號－2×0516－2 F2群體的193個單株進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，共擴(kuò)增出99條特異帶，平均每對引物擴(kuò)增出4.95條特異帶。對每個標(biāo)記的帶型在F2群體中的分布進(jìn)行χ2測驗(yàn)，結(jié)果基本符合3:1的分離比例，有4個位點(diǎn)產(chǎn)生偏分離（P＜0.05），偏分離比例為4.04%。偏分離的原因可能是由于環(huán)境因素造成的配子比例失調(diào)。

2.3 F2群體遺傳距離的確定

采用Mapmaker3.0軟件對分離群體單株的裸仁性狀和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，找到4個與裸仁基因n連鎖的分子標(biāo)記，分別為：E19M60－C、E22M48－B、E13M60－A 和 E25M51－D，遺傳距離分別為8.9、14.1、17.5和18.8 cM（見圖1）。

圖1 裸仁基因的AFLP標(biāo)記定位Fig.1 Location of hull-less n gene by AFLP technique

2.4AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記

將含有目的DNA片段的菌液，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，結(jié)果表明序列的兩端均有AFLP引物的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了克隆片段的正確性。堿基序列見圖2，該片段長度為318 bp。

圖2 E19M60-C片段核苷酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of fragment E19M60-C

在NCBI中檢索與其具有相似性的基因信息，在核苷酸水平與在氨基酸水平均未發(fā)現(xiàn)明顯同源序列，推測為南瓜的一段新的基因片段。

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計SCAR引物，在55℃退火條件下獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物大小為318 bp，與其相對應(yīng)的AFLP標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果完全對應(yīng)，命名為SCAR318。以此引物對F2群體中的單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證SCAR標(biāo)記的穩(wěn)定性，以確定SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化的正確性。其部分?jǐn)U增結(jié)果見圖3所示。結(jié)果表明，該對引物在裸仁親本、F1和F2代表現(xiàn)裸仁的單株中有擴(kuò)增，在有殼親本及F2代表現(xiàn)有殼的單株中無擴(kuò)增。

本研究中將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，長度為318 bp。

圖3 SCAR標(biāo)記在部分F2代群體的檢測結(jié)果Fig.3 Detection of the SCAR marker in F2population and parents

3 討論

無殼南瓜與有殼南瓜正反交，其F1代種子均表現(xiàn)為有殼，表明種殼性狀由核基因控制。雜種F2代有殼與無殼的分離比例為3∶1，回交后代其分離比例為1∶1，表明無種殼（裸仁）性狀的基因突變系點(diǎn)突變，是一對質(zhì)量性狀，無殼性狀系隱性基因控制，這與以往研究結(jié)果相一致[2-4,8]。另外，在F2代中，無殼種子不同程度地出現(xiàn)了帶薄殼現(xiàn)象，這些薄殼的表現(xiàn)從種子邊緣帶殼到全種子表面帶薄殼的連續(xù)表現(xiàn)的性狀，推測南瓜種殼性狀遺傳還存在修飾基因控制，通過修飾基因控制這樣一個連續(xù)變異的性狀，張仲保等研究表明種子薄殼是數(shù)量性狀，系修飾基因控制，估算種子薄殼遺傳中至少涉及38對基因[8]，Teppner認(rèn)為至少受到9個微效基因的修飾[9]，表明無種殼性狀遺傳比較復(fù)雜，不僅是簡單的單基因控制，還受到其他微效基因的控制，需要進(jìn)一步明確其遺傳機(jī)理。

目前關(guān)于南瓜裸仁基因定位研究比較少。Zraidi等利用RAPD、AFLP、SSR和形態(tài)標(biāo)記技術(shù)，對南瓜裸仁基因n進(jìn)行定位，分別對兩個F2代群體分析，找到了7個標(biāo)記與裸仁基因n距離小于7 cM，其中AW11-420與n相距4 cM[10]；本研究以F2群體為試驗(yàn)材料采用AFLP標(biāo)記對南瓜種殼性狀進(jìn)行標(biāo)記，獲得4個與無殼（裸仁）性狀連鎖的分子標(biāo)記，最近的標(biāo)記為E19M60-C。本試驗(yàn)得出的標(biāo)記遺傳距離較遠(yuǎn)，可能是由于引物數(shù)量少及試驗(yàn)所用群體有關(guān)，因此，應(yīng)加大引物量，構(gòu)建近等基因系或重組群體以便找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記。另外，獲得的SCAR標(biāo)記只是在親本、F1和部分F2代中驗(yàn)證與無殼表型的一致性，還應(yīng)在其他種質(zhì)資源材料中進(jìn)一步驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，以確定其使用價值。

4 結(jié)論

本研究以有殼品系“金輝二號-2”為母本和無殼品系“0516-2”為父本配制組合，獲得F1、F2和回交世代群體，遺傳規(guī)律分析表明，無種殼（裸仁）性狀是受一對隱性核基因所控制，而且獨(dú)立遺傳，當(dāng)隱性基因?yàn)橥|(zhì)時，種殼性狀表現(xiàn)為無殼（裸仁）。以193個F2單株作為作圖群體，利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)和集群分析法對與美洲南瓜裸仁基因連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行研究，找到了與裸仁基因n連鎖的4個AFLP標(biāo)記：E19M60-C、E22M48-B、E13M60-A和E25M51-D，連鎖遺傳距離分別為8.9、14.1、17.5和18.8cM。并將E19M60-C轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

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