練冬梅 賴正鋒 姚運(yùn)法

摘要：以玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa Linnaeus）花瓣和花萼為研究對(duì)象，采用Illumina HiseqTM 2500高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)花瓣和花萼進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及花青素合成相關(guān)基因差異表達(dá)分析。結(jié)果表明，花瓣和花萼共獲得13.94 Gb有效數(shù)據(jù)（clean data），Q30堿基百分比均達(dá)到93.0%以上;共獲得1 399個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），包括65個(gè)上調(diào)基因，1 334個(gè)下調(diào)基因，且功能注釋的基因有1 176個(gè);篩選出了與花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因CHI、FLS、ANR、CHI在花萼中表達(dá)顯著，F(xiàn)LS、ANR在花瓣中表達(dá)顯著。本研究豐富了花青素相關(guān)研究，可為闡明玫瑰茄花青素合成機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：玫瑰茄;花瓣;花萼;轉(zhuǎn)錄組;花青素;差異表達(dá)基因

中圖分類(lèi)號(hào)： Q786;S681.901? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）06-0041-05

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.）為錦葵科木槿屬一年生草本植物，別稱(chēng)洛神花（roselle、gongura）、芙蓉茄、山茄子、紅果梅、蘇丹茶、美麗納等。原產(chǎn)西非至南亞，廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，玫瑰茄在臺(tái)灣、廣西、廣東、福建和云南等南部地區(qū)均有栽培。玫瑰茄2004年被衛(wèi)生部和衛(wèi)計(jì)委列入新食品原料名單[1]，是一種藥食兩用的植物。玫瑰茄花重要部位花瓣（亮黃色）和花萼（紫紅色）具有藥用功能，均是具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值的器官，富含花青素、黃酮、多酚酸、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分，花瓣部位主要用于開(kāi)發(fā)花茶，而花萼部位利用率最高，已廣泛用于制作玫瑰茄醬[2]、飲料[3]、酸奶[4]、果酒[5]等，在食品工業(yè)中被用作著色、調(diào)味添加劑;花萼具有利尿、抗氧化、抗癌、降血壓、降血脂和降血糖等保健功能[6-9]，在玫瑰茄保健品開(kāi)發(fā)方面具有巨大潛力。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)對(duì)玫瑰茄研究主要集中在栽培技術(shù)、化學(xué)成分及功效分析、玫瑰茄花青素及玫瑰茄產(chǎn)品加工技術(shù)上，但其理論基礎(chǔ)研究還很薄弱，例如玫瑰茄花青素合成相關(guān)代謝途徑的研究尚屬空白。

花青素是構(gòu)成植物顏色的主要水溶性色素之一，屬于類(lèi)黃酮，主要以糖苷的形式存在于植物液泡中[10]，迄今從自然界分離和鑒定出的花青素苷多達(dá)600種，主要從矢車(chē)菊素苷元（cyanidin）、飛燕草素苷元（delphinidin）、天竺葵素苷元（pelargonidin）、芍藥花素苷元（peonidin）、矮牽牛素苷元（petunidin）、錦葵素苷元（malvidin）等6種花青素苷元衍生而來(lái)[11]。花青素苷合成始于苯丙氨酸，途經(jīng)多步酶促反應(yīng)，主要由上游基因（CHS、CHI、F3H、F3′H和F3′5′H等）和下游基因（DFR、ANS、GT、AT和MT等）參與表達(dá)。研究表明，植物花青素兼具營(yíng)養(yǎng)、藥理以及基因工程中改良花色等作用[12-14]。近年來(lái)，已有許多生物通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)完成了全轉(zhuǎn)錄功能基因組測(cè)序[15-16]。關(guān)于花青素合成相關(guān)基因在其他植物中也有相關(guān)研究[17-18]。玫瑰茄分子遺傳學(xué)與功能基因組學(xué)研究較落后，眾多玫瑰茄農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚，關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一種鑒定調(diào)控目標(biāo)性狀候選基因的新方法。本研究利用Illumina HiseqTM 2500高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玫瑰茄花瓣、花萼進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其花青素合成代謝途徑相關(guān)基因分析，探討玫瑰茄花瓣、花萼花青素合成機(jī)制和相關(guān)差異表達(dá)基因，以期為后續(xù)玫瑰茄相關(guān)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玫瑰茄為福建省漳州市漳浦縣種植品種，種植地點(diǎn)位于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，2017年6月15日種植，8月25日開(kāi)始采集樣品。采集標(biāo)準(zhǔn)：分別采集同一株玫瑰茄的花蕾（開(kāi)花前一天09：00采集）10朵，共3株，將花蕾的花瓣和花萼分離后進(jìn)行混合，立即用液氮速凍，置于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝 采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒提取玫瑰茄花瓣、花萼的總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100技術(shù)檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度和完整性，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，再使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，用Illumina HiseqTM 2500進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)過(guò)濾后去除其中的接頭序列及低質(zhì)量讀序（reads），獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)（clean data），用Trinity軟件對(duì)clean data進(jìn)行組裝，組裝成為轉(zhuǎn)錄本序列（transcripts），將不同樣品組裝結(jié)果中多個(gè)可變剪接的transcripts聚類(lèi)到一個(gè)基因，得到單基因序列（unigene）庫(kù)。

1.2.2 差異基因的功能注釋 使用BLAST軟件將Unigene與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、NOG、KEGG、Pfam等8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（E值≤10-5），獲得Unigene的注釋信息。

1.2.3 花青素合成相關(guān)差異基因分析 利用上述數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)玫瑰茄花瓣、花萼花青素合成進(jìn)行檢索，分析花青素合成相關(guān)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋及代謝路徑。按照FPKM（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段）法計(jì)算差異基因的表達(dá)量，如果倍數(shù)變化（log2 Fold change）>0，認(rèn)為是上調(diào)表達(dá)，反之，便認(rèn)為是下調(diào)表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)組裝及分析

玫瑰茄花瓣和花萼經(jīng)高通量測(cè)序和質(zhì)量控制，共獲得13.94 Gb clean data，其中花瓣clean data為7.29 Gb，花萼clean data為6.65 Gb，其Q30堿基百分比均達(dá)到93.0%以上，表明測(cè)序結(jié)果可靠，可用于后續(xù)的分析。對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1），總共產(chǎn)生72 029條單基因序列和148 309條轉(zhuǎn)錄本序列，N50（對(duì)一條染色體進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的reads進(jìn)行拼接，當(dāng)拼接的序列長(zhǎng)度達(dá)到染色體長(zhǎng)度的一半時(shí)，叫做N50長(zhǎng)度）分別為1 010、1 274 bp，組裝完整性較高;其中長(zhǎng)度區(qū)間位于 200～300 bp的Unigene數(shù)量最多，為24 697條，占34.29%。

2.2 Unigene功能注釋

為獲得Unigene的功能注釋信息，通過(guò)NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、NOG、GO、Pfam等8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析（表2），在72 029條Unigene中，共獲得44 887條（62.32%）Unigene的注釋。以上8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析中，分別獲得44 274（61.47%）、27 510（38.19%）、15 908（22.09%）、10 438（14.49%）、23 790（33.03%）、40 386（56.07%）、20 981（29.04%）、25 191條（34.97%）Unigene功能注釋。

2.3 差異表達(dá)基因（DEGs）分析

通過(guò)對(duì)玫瑰茄花瓣和花萼差異基因的表達(dá)分析，共獲得1 399個(gè)DEGs，包括65個(gè)上調(diào)基因，1 334 個(gè)下調(diào)基因;將DEGs單基因序列分別注釋到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NOG、NR等8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，共獲得1 176條基因功能注釋?zhuān)渲蠧OG數(shù)據(jù)庫(kù)267條，GO數(shù)據(jù)庫(kù)526條，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)285條，KOG數(shù)據(jù)庫(kù)562條，Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)853條，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)773條，NOG數(shù)據(jù)庫(kù)1 066條，NR數(shù)據(jù)庫(kù)1 165條，其中NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋比最高，達(dá)99.06%。

2.3.1 GO功能注釋 對(duì)玫瑰茄花瓣和花萼的DEGs進(jìn)行GO功能注釋?zhuān)卜譃槿箢?lèi)，分別為生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）。GO分類(lèi)統(tǒng)計(jì)顯示，526條DEGs被歸到40個(gè)功能小類(lèi)（表3）。生物學(xué)過(guò)程中DEGs在單一生物過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程3個(gè)功能小類(lèi)中分布數(shù)量最多;細(xì)胞組分中DEGs在細(xì)胞、細(xì)胞成分和膜結(jié)構(gòu)3個(gè)功能小類(lèi)中分布數(shù)量最多;分子功能中DEGs在催化活性和結(jié)合活性2個(gè)功能小類(lèi)中分布數(shù)量最多。

2.3.2 COG功能注釋 在玫瑰茄花瓣和花萼的轉(zhuǎn)錄本中，將注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的267條DEGs進(jìn)行直系同源分類(lèi)，并獲得21個(gè)功能分類(lèi)（圖1），差異基因注釋主要集中在R（一般性功能預(yù)測(cè)）、T（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制）、K（轉(zhuǎn)錄）和L（復(fù)制、重組和修復(fù)）中。

2.3.3 KEGG功能注釋 將DEGs通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（表4），有283個(gè)DEGs得到注釋?zhuān)謩e富集在64條代謝通路，其中涉及較多的是淀粉和蔗糖代謝（38個(gè)）、戊糖和葡萄糖醛酸互相轉(zhuǎn)化（35個(gè)）、植物病原體相互作用（24個(gè)）、甘油磷脂代謝（11個(gè)）、胞吞作用（11個(gè)）和苯丙素生物合成（10個(gè)）等。本研究著重選擇與花青素合成密切相關(guān)的代謝通路[類(lèi)黃酮生物合成（5個(gè)）]，并找到與花青素代謝相關(guān)的差異基因。

2.4 花青素合成相關(guān)基因差異性分析

通過(guò)對(duì)玫瑰茄花瓣和花萼轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能注釋、功能分類(lèi)及代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)（表5），花青素合成途徑中，查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶（chalcone isomaerase，CHI）基因在玫瑰茄花萼中具有顯著表達(dá)優(yōu)勢(shì)，上調(diào)表達(dá)4.9倍，黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）、花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）基因則在玫瑰茄花瓣中具有顯著表達(dá)優(yōu)勢(shì)。這些差異表達(dá)基因參與著玫瑰茄花瓣和和花萼的花青素合成代謝途徑，影響著玫瑰茄花青素的合成。

3 討論

本研究通過(guò)Illumina HiSeqTM 2500高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建玫瑰茄花瓣和花萼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，比較分析花瓣和花萼數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)花青素合成相關(guān)代謝途徑中差異表達(dá)的基因。

玫瑰茄花瓣、花萼中花青素代謝表現(xiàn)：p-香豆酰-輔酶A（p-coumaroyl-CoA）和3分子丙二 醛- 輔酶A （3×Malnoyl-CoA）， 在查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）催化下，生成查爾酮（chalcone），查爾酮又在CHI作用下形成柚皮素（naringenin，NAR），此過(guò)程花萼中CHI基因表達(dá)比花瓣顯著，將大量查爾酮轉(zhuǎn)化成花青素合成代謝所必需的NAR;玫瑰茄花瓣、花萼中NAR在黃烷 酮-3-羥基化酶 （flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）催化下產(chǎn)生二氫山奈酚（dihydokaempferol，DHK），DHK分別在類(lèi)黃 酮-3′-羥基化酶（flavonoid-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）和類(lèi)黃酮-3′5′-羥基化酶（flavonoid-3′5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）作用下生成二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），DHK、DHQ和DHM在二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）作用下分別生成無(wú)色天竺葵苷元（leucopelargonidin）、無(wú)色矢車(chē)菊苷元（leucocyanidin）和無(wú)色飛燕草素苷元（leucodelphinidin），而后分別在花青素苷合成酶（anthocyanin synthase，ANS）作用下生成有色的天竺葵苷元（pelargonidin）、矢車(chē)菊苷元（cyanidin）和飛燕草素苷元（delphinidin），各種花青素苷元分別在葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferases，GT）等作用下，生成穩(wěn)定的花青素苷。此過(guò)程中玫瑰茄花瓣中FLS和ANR基因顯著表達(dá)，進(jìn)入黃酮醇代謝途徑和原花青素代謝途徑，說(shuō)明FLS、ANR可能通過(guò)底物競(jìng)爭(zhēng)方式影響花青素合成，而玫瑰茄花萼CHI上調(diào)表達(dá)，F(xiàn)LS和ANR下調(diào)表達(dá)，有利于花青素合成。本研究豐富了花青素相關(guān)研究，可為闡明玫瑰茄花青素合成機(jī)制提供理論依據(jù)。

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