解麗艷 王云英 溫成泉 張七一 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是一種由遺傳因素與環(huán)境因素共同作用而引起的多基因遺傳性疾病，隨著高血壓遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)端粒損耗特別是染色體的丟失會(huì)導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，端粒長度隨年齡改變將會(huì)影響年齡依賴性高血壓相關(guān)基因的表達(dá)，端粒損耗可能參與高血壓發(fā)生發(fā)展的病理過程，白細(xì)胞端?？s短可能是高血壓患者易患動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一。因此，本文擬探討高血壓患者白細(xì)胞端粒長度的變化及與高血壓相關(guān)危險(xiǎn)因素的關(guān)系，以期進(jìn)一步了解高血壓致動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 根據(jù)2005年《中國高血壓防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn):收縮壓(SBP)≥140 mmHg或舒張壓(DBP)≥90 mmHg或正在服用降壓藥物者，選取高血壓患者162例，男84例，女78例，平均年齡(71.0±6.3)歲。同時(shí)選擇年齡、性別相匹配的健康對照者112例，男59例，女53例，平均年齡(70.8±5.5)歲。兩組入選對象均來自青島地區(qū)漢族人群，無血緣關(guān)系，排除繼發(fā)性高血壓、嚴(yán)重急慢性感染、心力衰竭、支氣管哮喘、自身免疫病及腫瘤患者。

1.2 研究方法

1.2.1 頸動(dòng)脈超聲 應(yīng)用美國GE-vivid5型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率5.0～10.0 MHz，由專人進(jìn)行測量。血管內(nèi)徑測定:測量頸總動(dòng)脈分叉近段1.5 cm處的內(nèi)徑，于心室收縮期及舒張期末期分別測量頸總動(dòng)脈前壁中膜-外膜交界區(qū)與后壁內(nèi)膜-血管腔交界區(qū)的垂直距離，每次測量3個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值。根據(jù)收縮期血管內(nèi)徑(Ds)和舒張期血管內(nèi)徑(Dd)計(jì)算橫斷面膨脹系數(shù)(cross-sectional distensibility coefficient，CSDC)和硬化參數(shù)(stiffness parameter)β。CSDC計(jì)算公式為:CSDC=(Ds2-Dd2)/Dd2×(SBP-DBP);硬化參數(shù)β=㏑(SBP/DBP)/〔(Ds-Dd)/Dd〕。

1.2.2 外周血白細(xì)胞端粒長度測定 抽取空腹外周靜脈血3 ml，-80℃保存。統(tǒng)一提取基因組DNA?；蚪MDNA提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司(產(chǎn)品編號:W6531)，嚴(yán)格按照說明書操作。紫外分光光度儀檢測提取DNA的濃度及純度，OD260/280≥1.8為合格，用于測定端粒長度。應(yīng)用LightCycler2.0(Roche，Mannheim，Germany)熒光定量 PCR 儀擴(kuò)增端粒和單拷貝基因36B4。測出端粒重復(fù)序列的拷貝數(shù)(telomere repeat copy number)與單拷貝基因拷貝數(shù)(single copy gene copy number)的比值(T/C)，該值與端粒的平均長度成線性相關(guān)〔1〕，從而得出相對端粒長度。端粒及36B4引物序列分別為:端粒:前向 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3';反向 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3';36B4:前向5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3';反 向 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'。反應(yīng)體系為:LightCycler?Fast-Start Reaction MixSYBR GreenⅠ，10 × conc.(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)10 μl，MgCl23 mmol/L，引物各0.15μmol/L，尿嘧啶 DNA糖基酶(UNG)0.1 U。反應(yīng)條件為:37℃ 120 s激活 UNG，95℃ 10 min滅活UNG同時(shí)激活FastStart酶，端粒擴(kuò)增條件為:95℃ 5 s，63℃5 s，72℃ 20 s，30 個(gè)循環(huán)，退火轉(zhuǎn)換速率為 4℃ /s?；?36B4擴(kuò)增條件為:95℃ 5 s，58℃ 10 s，72℃ 40 s。共30 個(gè)循環(huán)，退火轉(zhuǎn)換速率為20℃/s。用倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品濃度5～80 ng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在PCR過程中設(shè)立無模板陰性對照(no templates control，NTC)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，以鑒定產(chǎn)物是否單一。相對端粒長度的計(jì)算方法參照曹東維和Brouilette方法執(zhí)行〔2，3〕，所得相對端粒長度與Southern印跡方法的結(jié)果一致〔4，5〕。

1.2.3 血脂、血糖檢測 采用酶法測定血漿總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平;直接測定法測定血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平;雙波長免疫透射比濁法測定血漿載脂蛋白 A1(ApoA1)、載脂蛋白 B(ApoB)水平;己糖激酶法測定空腹血糖(FPG)水平，以上所有項(xiàng)目均在日立7170自動(dòng)生化分析儀上測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示。兩組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);端粒長度比值在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，其與各參數(shù)間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析或偏相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和融解曲線 在退火溫度升至63℃、退火及延伸時(shí)間分別降至5 s和20 s的情況下，端粒和基因36B4的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別是-3.693和-3.520(見圖1)，反應(yīng)效率分別是1.87和1.92。融解曲線未發(fā)現(xiàn)非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)(見圖2)。

圖1 端粒及36B4的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 研究對象的一般資料 高血壓組與對照組之間性別、年齡、飲酒史無顯著性差異 (P＞0.05)。高血壓組的BMⅠ、SBP、DBP、TC、TG和LDL均顯著高于對照組(P＜0.01);而HDL明顯低于對照組(P＜0.01)。高血壓組CSDC顯著低于對照組(P＜0.01)，而硬化參數(shù)β顯著高于對照組(P＜0.05)。吸煙史、高血壓家族史兩組之間有顯著性差異(P＜0.01)。兩組間的FPG、ApoA1和 ApoB水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

2.3 外周血白細(xì)胞相對端粒長度的變化 275例研究對象的相對端粒長度參照相關(guān)文獻(xiàn)〔3，6〕進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換后的端粒長度比值與年齡呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.345，P＜0.001)，高血壓組和對照組的相關(guān)系數(shù)分別為:-0.306(r2=0.094，95%CI-0.020 ～ -0.007，P ＜0.001)和 -0.357(r2=0.127，95%CI-0.024～-0.008，P＜0.001)。高血壓組和對照組的相對端粒長度比較有顯著性差異，高血壓組較對照組顯著縮短(P＜0.01)。兩組端粒長度比值經(jīng)年齡校正后與CSDC呈顯著正相關(guān);與硬化參數(shù)β呈顯著負(fù)相關(guān);偏相關(guān)系數(shù)分別為0.286(r2=0.094，P ＜0.001)和 -0.126(r2=0.016，P=0.037)。高血壓組端粒長度比值與CSDC的相關(guān)性較對照組弱，高血壓組和對照組偏相關(guān)系數(shù)分別為0.133(P=0.045)和0.406(P＜0.001);兩組端粒長度比值與硬化參數(shù)β的相關(guān)性相似。但兩組端粒長度比值經(jīng)年齡校正后與ApoA1、ApoB、HDL、LDL和TC的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖2 端粒及36B4的融解曲線

表1 研究對象的端粒長度和各生化指標(biāo)比較

圖3 高血壓組和對照組端粒長度比值與年齡、CSDC及硬化參數(shù)β的關(guān)系

3 討論

端粒是位于真核細(xì)胞染色體兩端一段特殊的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，由短串聯(lián)重復(fù)序列(TTAGGG)n和與之相連的端粒結(jié)合蛋白組成。人端粒是以5'-TTAGGG-3'為重復(fù)單位的富含鳥苷酸的序列，具有保護(hù)末端免于降解，防止染色體斷裂、融合、重組和丟失，維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能。出生時(shí)新生兒的端粒長度無性別差異，并且新生兒外周血白細(xì)胞、臍血和皮膚成纖維細(xì)胞的端粒長度高度一致。人類精子端粒長度約為15 kb;外周血細(xì)胞端粒長約7 000～10 000 bp;端粒平均長度為5～15 kb。成人端粒長度的變化是一個(gè)慢性損耗過程，是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。與年齡相關(guān)的高血壓是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的異質(zhì)性疾病，因此，端粒長度的變化很可能與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文對163例高血壓患者和112例健康對照者端粒長度的研究結(jié)果顯示:高血壓組外周血白細(xì)胞相對端粒長度(T/S比值)較對照組明顯縮短，且與年齡呈顯著負(fù)相關(guān)，表明高血壓患者存在端粒長度過度耗損;或者隨著年齡增長端粒長度耗損可能是高血壓發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。此結(jié)果與 Huzen〔7〕和 Brouilette〔3〕的研究結(jié)果一致。

高血壓是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素。有學(xué)者觀察到，高血壓患者血白細(xì)胞中端粒長度縮短程度與動(dòng)脈粥樣硬化程度顯著相關(guān)〔8〕，高血壓伴頸動(dòng)脈粥樣斑塊形成者較無斑塊者端粒長度顯著縮短〔9〕。本研究結(jié)果也顯示:高血壓組外周血白細(xì)胞相對端粒長度與CSDC呈正相關(guān)，與頸動(dòng)脈硬化參數(shù)β呈負(fù)相關(guān)，提示端粒長度縮短與高血壓患者動(dòng)脈彈性有關(guān)。端粒長度的變化可能是生物血管齡的標(biāo)志之一，它反映了動(dòng)脈系統(tǒng)伴隨年齡的衰老過程，端粒耗損可能參與這一高血壓動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜病理過程，主要危險(xiǎn)因素包括年齡、血脂異常、血壓、吸煙、糖尿病和糖耐量異常等。盡管研究表明端粒功能失調(diào)與上述因素密切相關(guān)，本研究也顯示，端粒參與高血壓動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，但其病理過程目前尚不清楚。有研究表明，端粒長度與高血壓血管內(nèi)皮炎癥〔10〕、氧化應(yīng)激〔11〕、高半胱氨酸血癥〔12〕、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)〔13〕、葉酸代謝〔14〕等有關(guān)。炎癥反應(yīng)可造成DNA損傷，DNA斷裂片段堆積降低了DNA的修復(fù)效率，致端粒耗損加速〔15〕。用高半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮培養(yǎng)細(xì)胞加速衰老，發(fā)現(xiàn)高半胱氨酸慢性刺激形成的慢性氧化壓力增加了細(xì)胞間黏附分子-1(ⅠCAM-1)和Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(PAⅠ-1)的表達(dá)水平，使端粒長度的損失量增加，致端粒縮短，進(jìn)一步加速內(nèi)皮細(xì)胞衰老導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化，提示端?？s短可能為氧化損傷學(xué)說與動(dòng)脈粥樣硬化之間提供了一種鏈接〔12〕。ox-LDL和葉酸代謝也分別通過影響端粒酶活性〔13〕和DNA甲基化而影響端粒長度〔14〕。但在本研究中，兩組端粒長度比值與ApoA1、ApoB、HDL、LDL和TC的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Brouilette等的研究結(jié)果一致〔3〕。脂質(zhì)代謝紊亂是一個(gè)復(fù)雜的過程，任何單一指標(biāo)很難全面反映代謝狀態(tài)。而動(dòng)脈彈性改變往往是長期的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的結(jié)果，是血管內(nèi)皮功能、動(dòng)脈血流切應(yīng)力改變、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等引起血管病變后期的表現(xiàn)，在本研究中，動(dòng)脈彈性指標(biāo)與端粒長度相關(guān)，且其相關(guān)性在對照組較高血壓組更好，表明端粒長度與動(dòng)脈彈性的關(guān)系可能有一定的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，二者的關(guān)系尚需更多的研究加以證實(shí)。

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