楊松林 王清勇 向光紅 易艷輝 朱德茂

湖南省腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 長(zhǎng)沙 410007

細(xì)胞治療或細(xì)胞替代治療是近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和前沿,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一群具有向多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,BMSCs腦內(nèi)移植可以明顯改善卒中大鼠的肢體功能。有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞(UCBMSCs)的體外擴(kuò)增能力、細(xì)胞原始性均高于骨髓,并具有很強(qiáng)的可塑性[1]。本文分離培養(yǎng)人UCBMSCs,早期移植給大腦中動(dòng)脈閉塞(MACO)模型大鼠,觀察其對(duì)大鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選擇清潔級(jí)健康雄性SD大鼠36只,隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=12)、對(duì)照組(n=12)和移植組(n=12)。試劑:特優(yōu)級(jí)胎牛血清(杭州四季青公司),DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO),人淋巴細(xì)胞分離液(1.077g/mL,天津TBD公司),CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 3111),SP試劑盒(北京中杉金橋公司),鼠抗人CD44,CD34單克隆抗體,鼠單抗BrdU抗體(武漢博士德公司),TUNEL試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 UCB-MSCs的分離、培養(yǎng) 經(jīng)產(chǎn)婦同意,采集我院產(chǎn)科健康分娩新生兒臍帶血。新生兒娩出正常斷臍帶后,常規(guī)消毒臍帶側(cè),用一次性采血袋收集臍帶血,搖勻后冰盒保存,4 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室行細(xì)胞分離。臍血與PBS按1∶1混勻,疊加于人淋巴細(xì)胞分離液上,2000 rpm離心20 min。小心吸取界面單個(gè)核細(xì)胞層,加入5倍體積的PBS緩沖液,1200 rpm離心5 min,洗滌2次,棄上清。所得單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色,光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)達(dá)85%以上方進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL接種于含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天半量換液,72 h后更換培養(yǎng)基,去掉未貼壁的細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,每3 d換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合, 0.25%胰蛋白酶消化,1∶2傳代培養(yǎng)。

1.3 UCBMSCs表面標(biāo)志的鑒定 制備細(xì)胞涂片,以PBS沖洗2遍,4%多聚甲醛4℃固定20 min,蒸餾水沖洗2次, PBS沖洗3×5 min,每孔加3%雙氧水室溫孵育20 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶;PBS沖洗3×5 min,加入0.3%TritonX-100,室溫孵育30 min加強(qiáng)抗體進(jìn)入胞漿。PBS沖洗后以封閉血清封閉30 min,吸出血清分別加入1∶100抗CD44抗體、1∶200抗CD34抗體,4℃孵育過(guò)液,PBS洗去一抗,按SP試劑盒說(shuō)明完成免疫細(xì)胞化學(xué)各步驟,DAB顯色,常規(guī)脫水透明封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)至少400個(gè)分散細(xì)胞,并計(jì)數(shù)CD44、CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 大鼠MACO模型制作 對(duì)照組和移植組采用線栓法制作MACO模型,術(shù)前禁食12 h,不禁水,用100 g/L的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,在頸部中央切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈,于頸總動(dòng)脈分叉下方剪一切口,將一預(yù)先用乙醇燈燒成圓頭的尼龍線(4～0號(hào),圓頭直徑0.3 mm)置入頸內(nèi)動(dòng)脈18 mm左右,直到有輕微阻力感為止,阻閉120 min后抽出尼龍線,恢復(fù)再灌注。大鼠蘇醒后進(jìn)行大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評(píng)分:0分:無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向左側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,甚至意識(shí)喪失,5分:死亡。取2～3分者為試驗(yàn)對(duì)象。假手術(shù)組:僅行頸部正中切口暴露右頸總動(dòng)脈后縫合皮膚。

1.5 UCB-MSCs尾靜脈移植 選取生長(zhǎng)良好傳代臍血間充質(zhì)干細(xì)胞,移植前加入500 μ mol/L的BrdU孵育24 h,用0.25%胰蛋白酶室溫消化后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,加入含糖PBS,1200 rpm離心5 min,洗滌2次,將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/mL。模型制作完成后1 d、4 d進(jìn)行尾靜脈注射移植,移植組:經(jīng)尾靜脈注入BrdU標(biāo)記的MSCs細(xì)胞懸液1 mL。假手術(shù)組和對(duì)照組:經(jīng)尾靜脈注射不含MSCs的PBS 1 mL。于2次移植后7 d、14 d對(duì)移植組及對(duì)照組大鼠進(jìn)行進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,其后麻醉動(dòng)物,迅速開(kāi)胸暴露心臟,經(jīng)升主動(dòng)脈插管,多聚甲醛溶液灌注固定,斷頭取腦,從額部至枕部分為等份,取中間腦片石蠟包埋,組織常規(guī)切片,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞,T UNEL法檢測(cè)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,凋亡細(xì)胞以細(xì)胞胞核呈棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張免疫組化切片中采集10個(gè)具有代表性的高倍鏡非重疊視野,計(jì)算均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用(±s)表示,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析,以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 UCBMSCs分離與鑒定 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離效率較低,本研究共分離40份臍血,有6份分離出UCB-MSCs并能夠達(dá)到融合傳代,分離效率為15%。初次接種的細(xì)胞小而圓,呈懸浮狀態(tài),24 h后開(kāi)始有細(xì)胞貼壁,最初貼壁的MSCs散在、稀少,細(xì)胞呈橢圓形或紡錘形,懸浮細(xì)胞逐漸壞死破碎,3 d后更換培養(yǎng)基去掉未貼壁的細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng),可見(jiàn)少量貼壁細(xì)胞,呈單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞的克隆,有粗大突起伸出,5～7 d出現(xiàn)大量的貼壁細(xì)胞以間充質(zhì)細(xì)胞為主。經(jīng)多次傳代,UCBMSCs呈漩渦狀排列。細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示: CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均為1.8%,CD44陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為98.2%,細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 移植UCBMSCs在腦內(nèi)分布 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織中標(biāo)記的BrdU陽(yáng)性UCBMSCs表明,移植組7 d、14 d時(shí)有少量UCB-MSCs分布于梗死區(qū)周?chē)昂ｑR區(qū),左側(cè)正常腦組織中偶見(jiàn)。

2.3 UCBMSCs移植后2組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分對(duì)比 見(jiàn)表1。2組移植后神經(jīng)功能均逐漸改善,對(duì)照組7 d時(shí)與0 d時(shí)神經(jīng)功能略改善,統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異(t=2.236,P＞0.05),14 d時(shí)與0 d時(shí)神經(jīng)功能明顯改善(t=5.00,P＜0.05)。移植組7 d、14 d時(shí)神經(jīng)功能改善更明顯(t7=5.00,t14=6.325,P＜0.05),但與對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異(t7=-0.791, t14=-0.791,P＞0.05)。

表1 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較 (±s)

表1 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較 (±s)

注:與0 d比較,*P＜0.05

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2.4 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠7 d、14 d時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)比較 (個(gè)/HP,±s)

表2 各組大鼠7 d、14 d時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)比較 (個(gè)/HP,±s)

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05;與對(duì)照組組比較,#P＜0.05

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3 討論

MSC移植治療腦缺血疾病是目前細(xì)胞移植治療研究中最活躍的領(lǐng)域之一。Chen J等[2]對(duì)骨髓MSCs移植治療MCAO卒中大鼠進(jìn)行系列研究,從不同的途徑(經(jīng)頸動(dòng)脈、經(jīng)尾靜脈、經(jīng)腦內(nèi))將MSC注入的大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)MSCs移植能夠顯著降低神經(jīng)系統(tǒng)的功能損害。但是隨著年齡的增長(zhǎng)骨髓MSCs的數(shù)量、擴(kuò)增和分化能力也出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)[3],采集時(shí)對(duì)患者或供者仍有一定的損傷。近年來(lái)研究表明臍血中也含有豐富的MSCs[4-5],可以向三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞分化。臍帶血來(lái)源的MSCs優(yōu)勢(shì)主要在于:(1)臍血從分娩后的胎盤(pán)、臍帶殘端收集,其過(guò)程比從骨髓或胚胎獲取干細(xì)胞簡(jiǎn)單,對(duì)于新生兒及產(chǎn)婦沒(méi)有任何痛苦和不良影響,而易于接受,也不會(huì)涉及社會(huì)、倫理及法律方面的更多爭(zhēng)論; (2)臍血受胎盤(pán)屏障的保護(hù),其成分被病毒、細(xì)菌污染的概率低。臍血中MSCs較少,分離效率較低。本研究共分離40份臍血,有6份分離出UCB-MSCs并能夠達(dá)到融合傳代,分離效率為15%,仍需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

李建斌等[6]通過(guò)靜脈注射經(jīng)熒光DIL標(biāo)記的UCBMSCs在健康小鼠體內(nèi)各個(gè)器官分布情況:肝臟56%、脾臟26%、肺臟8%、腎臟6%、心臟3%、腦1%;在腦卒中小鼠模型體內(nèi)分布情況:肝臟52%、脾臟24%、肺臟9%、腎臟6%、心臟4%、腦5%。表明腦卒中發(fā)生后,病變臟器組織的數(shù)量增加。本研究也觀察到梗死側(cè)腦組織標(biāo)記細(xì)胞明顯增多,分析與血腦屏障開(kāi)放和梗死后炎癥因子招募有關(guān),也是MSC移植治療腦缺血疾病的基礎(chǔ)。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血性損傷的重要機(jī)制,通過(guò)各種途徑阻止細(xì)胞凋亡可以減輕腦損害。本研究表明未進(jìn)行UCBMSCs移植的對(duì)照組大鼠近期神經(jīng)功能也有一定程度改善,分析與腦的可塑性和自然修復(fù)有關(guān)。移植組改善更明顯,神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少,分析UCBMSCs通過(guò)增加缺血組織的生長(zhǎng)因子,減少缺血半暗帶細(xì)胞凋亡而改善神經(jīng)功能,但與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析與定植在損傷腦組織的UCBMSCs數(shù)量過(guò)少有關(guān)。UCBMSCs還是理想的種子細(xì)胞和基因轉(zhuǎn)移載體,移植治療缺血性腦損傷的途徑、劑量及方法尚需進(jìn)一步研究。

[1] Thalmeier K,Meissner P,Moosmann S,et al.M esenchy mal differentiation and organ distribution of established human stromal cell lines in NOD/SCID mice[J].Acta Haematol, 2001,105(3):159-165.

[2] Chen J,Zhang ZG,Li Y,et al.Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats[J].Circ Res,2003, 92:692-699.

[3] D'Ippolito G,Schiler PC,Ricordo C,et al.Age-relatd osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow[J].J Bone Miner Res,1999,14(7):1 115-1 122.

[4] Goodwin H,Bicknese A,Chien S,et al.M ultilineage differen-tiation activity by cells isolated from umbilical cord blood:expression of bone,fat,and neural markers[J].Biol Blood Marrow T ransplant,2001,7:581-588.

[5] Lee OK,Kuo TK,Chen WM,et al.Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood[J].Blood, 2004,103(5):1 669-1 675.

[6] 李建斌,焦紅亮,單泓,等.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在腦卒中小鼠模型主要器官分布研究[J].中國(guó)輸血雜志,2010,23(10):870-871.