馮 琳 姜 俊 劉 揚 胡 凱 姜維丹 周小秋*

(1.四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.魚類營養(yǎng)與安全生產四川省高校重點實驗室，雅安 325014)

大豆凝集素(SBA)主要存在于大豆子葉細胞蛋白體內，約為大豆蛋白質總量的10%［1］，是大豆中主要的抗營養(yǎng)因子之一。目前，魚粉不僅價格昂貴，而且資源短缺，限制了其在水生動物飼料中的大量使用。大豆蛋白氨基酸組成相對平衡，可利用蛋白質含量高，且價格合理、供應穩(wěn)定，是目前最合適的替代魚粉的植物蛋白質原料。然而，大豆中存在較多的抗營養(yǎng)因子，特別是SBA，在一定程度上限制了大豆蛋白的使用。目前未見SBA對鯉魚腸道結構和功能的影響的報道，但在其他動物上有少量的體內研究。這些研究發(fā)現(xiàn)，SBA能與大鼠［2］、仔豬［3］、大西洋鮭［4］的腸道上皮結合，破壞腸道結構，并導致大鼠腸道代償性增生。腸道是動物營養(yǎng)物質消化吸收的主要場所，魚類腸腔表面一般覆蓋著單層柱狀的腸道上皮細胞，是魚類消化和吸收營養(yǎng)物質的功能性細胞［5］。本研究擬用體外培養(yǎng)的鯉魚腸道上皮細胞為模型，研究培養(yǎng)液中添加不同濃度的純化SBA對鯉魚腸道上皮細胞結構及功能的影響，以及其可能的抗營養(yǎng)途徑，為進一步研究大豆蛋白在水生動物上的應用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑:純化SBA(98%)，為內蒙古真佳化工有限公司產品;胰島素、膠原酶(Ⅺ型)、中性蛋白酶(Ⅰ型)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、牛皮膠原蛋白(Ⅰ型)，均為美國 Sigma公司產品;山梨醇、DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清，均為美國Gibco公司產品;轉鐵蛋白，為美國Heyclone公司產品;氨檢測試劑盒，上海中生北控生物科技公司產品;堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉氨酶(GPT)、超微量Na+，K+-ATP酶、考馬斯亮藍總蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(GOT)等檢測試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產品;二甲基亞砜及其他常用試劑，均為國產分析純或生化試劑。

儀器:BB5060UV型細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，Wellsan MK型酶聯(lián)免疫分析儀(美國Thermo公司)，DV-800核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)，722型分光光度計、BCN-1360型生物潔凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)，普通正立顯微鏡(日本Olympus公司)，A200型倒置相差多功能生物顯微鏡及全自動顯微攝影裝置(德國Zeiss公司)以及普通離心機、微量加樣器等。

1.2 腸道上皮細胞的分離及接種培養(yǎng)

鯉魚腸道上皮細胞的分離參考姜?。?］的方法，具體如下:選體重約為100 g的健康建鯉，先剪去頭部，破壞其脊髓，剖開腹腔分離出腸道，徹底沖洗干凈后用眼科剪將腸道組織剪成小片，再用膠原酶(Ⅺ型)和中性蛋白酶(Ⅰ型)聯(lián)合分離組織小片，離心后分離出腸道上皮細胞。分離得到的腸道上皮細胞用適量無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液懸浮后，在普通顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)腸道上皮細胞數(shù)。

將腸道上皮細胞用DMEM高糖培養(yǎng)液(含2%胎牛血清)稀釋至每平方厘米400個細胞團，并分別接種于已用膠原蛋白涂抹的24孔細胞培養(yǎng)板中，共4塊板，每孔接種稀釋好的細胞懸液500μL。接種后在恒溫培養(yǎng)箱中26℃靜止培養(yǎng)72 h后，棄去原培養(yǎng)液，洗去雜質及未貼壁的死細胞，向其中3塊培養(yǎng)板(6個處理，每個處理接種12 孔)中分別加入含有 SBA 0、50、75、100、150 和200μg/m L的 DMEM 高糖培養(yǎng)液200μL，另外1塊培養(yǎng)板加入等量不含SBA的DMEM高糖培養(yǎng)液，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 細胞形態(tài)觀察

細胞培養(yǎng)144 h后，在倒置顯微鏡下利用透射明場相差相襯法直接觀察細胞的形態(tài)結構及生長情況，并攝像記錄。

1.4 樣品收集及指標測定

SBA處理后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集3塊培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清液，置于-20℃冰箱中保存，用于測定培養(yǎng)液中LDH、GPT和GOT活力，并取部分培養(yǎng)上清液立即測定培養(yǎng)液中氨濃度。

在收集培養(yǎng)上清液的培養(yǎng)板中加入適量的無血清的DMEM培養(yǎng)液，洗去懸浮的死細胞及雜質，然后在其中1塊培養(yǎng)板中加入含MTT的無血清的DMEM 培養(yǎng)液200μL，26℃培養(yǎng)6 h后于酶聯(lián)免疫分析儀上測定MTT OD值。

在收集培養(yǎng)上清液的其余2塊培養(yǎng)板中每孔加入 Tirs-HCl緩沖液 200μL，在室溫下溶解30 m in，收集細胞裂解液，置于-20℃冰箱中保存，用于SBA處理后細胞中蛋白質含量以及GPT、GOT、AKP、Na+，K+-ATP 酶活力的測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結果以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用 SPSS 13.0進行單因素方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 SBA處理后鯉魚腸道上皮細胞形態(tài)觀察

在不同濃度SBA的作用下，鯉魚腸道上皮細胞接種培養(yǎng)144 h后細胞形態(tài)變化情況如圖1所示。與未添加(0μg/m L)組相比，SBA的添加使鯉魚腸道上皮細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，且這種變化隨著SBA濃度的增加而更加明顯。SBA處理培養(yǎng)72 h(即接種培養(yǎng)144 h)后，未添加組的腸道上皮細胞輪廓清晰，呈正常的橢圓形，形成細胞片層結構(圖1-A);50μg/m L添加組的腸道上皮細胞結構被破壞，細胞呈條形，個別細胞出現(xiàn)腫脹，細胞輪廓不夠清晰(圖1-B);75μg/m L添加組的腸道上皮細胞中條形細胞增多，培養(yǎng)液中出現(xiàn)漂浮的死細胞殘骸，細胞輪廓不夠清晰(圖1-C);100μg/m L添加組的腸道上皮細胞輪廓模糊，液面漂浮的死細胞殘骸增多，細胞形狀不規(guī)則(圖1-D);150μg/m L添加組的腸道上皮細胞輪廓模糊，基本看不出細胞形態(tài)，細胞結構遭到嚴重破壞，液面漂浮的死細胞殘骸繼續(xù)增多(圖1-E);200μg/m L添加組的腸道上皮細胞輪廓完全不清晰，結構破壞更加嚴重，液面漂浮的死細胞殘骸繼續(xù)增多(圖1-F)。

圖1 SBA對鯉魚腸道上皮細胞形態(tài)的影響Fig.1 Influence of SBA on morphology of carp intestinal epithelial cells(200 × )

2.2 SBA對鯉魚腸道上皮細胞培養(yǎng)液中LDH、GPT、GOT活力的影響

SBA對鯉魚腸道上皮細胞培養(yǎng)液中LDH、GPT、GOT活力的影響見表1。添加SBA以后，培養(yǎng)液中LDH、GPT活力均有所增加，當SBA添加量為150和200μg/m L時，培養(yǎng)液中的LDH活力較未添加組和其他添加組極顯著升高(P＜0.01);同時，添加量為200μg/m L時LDH活力還顯著高于添加量為150μg/m L時(P＜0.05);SBA添加量達到200μg/m L時，培養(yǎng)液中GPT活力與添加量為0、50和75μg/m L時相比極顯著升高(P＜0.01)，與添加量為100和150μg/m L時相比顯著升高(P＜0.05)。SBA添加量對培養(yǎng)液中 GOT活力的影響不顯著(P＞0.05)。

表1 SBA對鯉魚腸道上皮細胞培養(yǎng)液中LDH、GPT和GOT活力的影響Table 1 The influence of SBA on activities of LDH，GPT and GOT in culturemedium for carp intestinal epithelial cells

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)。下表同。

In the same row，values w ith different small letter superscriptsmean significant difference(P ＜0.05)，and w ith different capital letter superscriptsmean significant difference(P ＜0.01).The same as below.

2.3 SBA對鯉魚腸道上皮細胞中MTT OD值以及AKP、Na+，K+-ATP 酶活力的影響

SBA對鯉魚腸道上皮細胞中MTT OD值以及AKP、Na+-K+-ATP酶活力的影響見表2。添加SBA以后，細胞中MTT OD值有所升高，當SBA添加量為150和200μg/m L時，培養(yǎng)液中 MTT OD值較未添加組顯著升高(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)。與未添加組相比，各添加組細胞中AKP、Na+，K+-ATP酶活力均極顯著降低(P ＜0.01)。

表2 SBA對鯉魚腸道上皮細胞中AKP、Na+，K+-ATP酶活力以及MTT OD值的影響Table 2 The influence of SBA on AKP and Na+，K+-ATPase activities，and MTT OD value in carp intestinal epithelial cells

2.4 SBA對鯉魚腸道上皮細胞中 GPT、GOT活力的影響

SBA對鯉魚腸道上皮細胞中GPT、GOT活力的影響見表3。當SBA添加量達到或超過150μg/m L時，細胞中的 GOP活力極顯著升高(P＜0.01);當 SBA添加量達到200μg/m L時，細胞中GOT活力極顯著升高(P＜0.01)。

表3 SBA對鯉魚腸道上皮細胞中GPT、GOT活力的影響Table 3 The influence of SBA on activities of GPT and GOT in carp intestinal epithelial cells U/mg prot

2.5 SBA對鯉魚腸道上皮細胞中蛋白質含量及培養(yǎng)液中氨濃度的影響

SBA對鯉魚腸道上皮細胞中蛋白質含量及培養(yǎng)液中氨濃度的影響見表4。SBA的添加顯著或極顯著增加了每孔細胞中蛋白質含量(P＜0.05或P＜0.01);同時，添加SBA以后，培養(yǎng)液中氨濃度均有所增加，當SBA添加量達到或超過75μg/m L時，培養(yǎng)液中的氨濃度顯著高于未添加和添加量為50μg/m L時(P＜0.05)，且當 SBA含量達到150μg/m L時，培養(yǎng)液中的氨濃度達到最大值。

表4 SBA對鯉魚腸道上皮細胞中蛋白質含量及培養(yǎng)液中氨濃度的影響Table 4 The influence of SBA on protein content in carp intestinal epithelial cells and ammonia concentration in culturemedium

3 討論

3.1 SBA對鯉魚腸道上皮細胞結構完整性的影響

LDH存在于細胞的胞漿內，當細胞結構遭到破壞時，LDH能迅速溢到胞外，從而導致胞外LDH活力迅速增加。從本試驗結果可知，隨著培養(yǎng)液中SBA添加量的增加，胞外LDH的活力呈線性增加。這說明SBA破壞了鯉魚腸道上皮細胞正常結構，且SBA劑量越大，破壞作用越嚴重。GPT絕大部分存在于細胞的胞質內，生物膜結構遭到破壞時溢到胞外。本試驗結果表明，SBA引起鯉魚腸道上皮細胞結構破壞后，導致胞質內GPT大量溢出胞外，SBA劑量越大，破壞越嚴重，溢出胞外量越大。

關于SBA對水生動物腸道上皮細胞結構破壞研究未見報道，但在有少量對水生動物體內腸道結構影響的研究。Burrells等［7］對鮭魚的研究表明，SBA導致鮭魚后腸皺襞破裂、黏膜上皮細胞脫落。Buttle等［4］研究發(fā)現(xiàn)，SBA嚴重破壞虹鱒和大西洋鮭腸道結構，特別是后腸結構被破壞程度更為嚴重;當飼喂大西洋鮭含3.5%SBA的飼料時，其后腸吸收小泡破裂或者萎縮，腸細胞出現(xiàn)腫大，細胞核結構變得模糊，刷狀緣膜崩解，黏膜脫落進入腸腔，固有層變寬。陸生動物體內研究發(fā)現(xiàn)，當飼糧中SBA的含量達到2.0 mg/g的時，大鼠的空腸正常結構被嚴重破壞，刷狀緣膜破裂，微絨毛排列紊亂、斷裂，并有大量上皮細胞脫落進入腸腔［2］;大豆蛋白中殘留的SBA對大鼠小腸細胞結構有破壞作用，并誘發(fā)小腸結構和功能的多種變化［8］。從本試驗細胞形態(tài)學觀察來看，SBA的添加嚴重破壞了細胞的正常形態(tài)，在細胞培養(yǎng)液中添加50μg/m L的SBA后，細胞的形態(tài)就發(fā)生了明顯變化，細胞由原有的橢圓形變?yōu)殚L形，細胞輪廓變得不清晰，個別細胞出現(xiàn)腫脹;SBA的添加量達到100μg/m L時，細胞形態(tài)變化更加明顯，細胞輪廓變得模糊，漂浮于液面的死細胞殘骸增多，細胞不具備規(guī)則的形狀;隨著SBA劑量的繼續(xù)增加，其形態(tài)結構變化越來越嚴重。上述結果表明，SBA的添加嚴重破壞了細胞的正常結構，且破壞程度隨SBA添加量的增加而增加。

3.2 SBA對鯉魚腸道上皮細胞增殖、分化及凋亡的影響

細胞MTT OD值可反映活細胞數(shù)量及細胞代謝的活躍程度。本試驗結果表明，隨著SBA添加量的增加，鯉魚腸道上皮細胞MTT OD值呈線性增加，說明SBA促進了鯉魚腸道上皮細胞的增殖。目前未見SBA對水生動物腸道上皮細胞增殖的影響的研究，陸生動物上少量的報道指出，SBA能引起大鼠腸道腺窩細胞數(shù)量顯著增加［2］，使大鼠腸道和胰腺出現(xiàn)代償性增生［9］。對其他植物凝集素的研究發(fā)現(xiàn)，菜豆凝集素(PHA)、麥胚凝集素(WGA)、花生凝集素(PNA)、伴刀豆凝集素(ConA)均能不同程度地引起全腸外營養(yǎng)大鼠胃腸道上皮細胞增生［10］。在本試驗中，SBA添加導致了鯉魚腸道上皮細胞的增殖，但是細胞結構卻遭到了嚴重破壞。進一步分析發(fā)現(xiàn)，細胞MTT OD值分別與培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶和谷丙轉氨酶的呈極顯著和顯著的正相關(r1=0.922 0，P ＜0.01;r2=0.829 0，P ＜0.05)，說明 SBA 可能引起鯉魚腸道上皮細胞代償性增殖。

AKP主要集中在腸道上皮細胞的紋狀緣部分，其活力可反映魚類腸道上皮細胞的分化成熟度［11］。本試驗結果表明，添加SBA后，鯉魚腸道上皮細胞AKP活力極顯著下降，說明SBA引起鯉魚腸道上皮細胞分化成熟受阻。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SBA添加導致細胞增殖，活細胞數(shù)量(以MTT OD值作為檢測指標)增加，但同時細胞AKP活力卻下降，說明在本試驗條件下SBA的添加導致鯉魚腸道上皮細胞成熟度降低可能由于代償性增生所致。

近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞的Na+，K+-ATP酶活性抑制會導致細胞凋亡，且在Na+，K+-ATP酶抑制引起的細胞凋亡中還觀察到了細胞腫脹、細胞器溶解等壞死特征，并同時兼具人們以前所觀察到的細胞染色質凝集、半胱天冬酶級聯(lián)反應等凋亡特征，這一現(xiàn)象被稱為雜合性細胞死亡［12］。本研究結果顯示，培養(yǎng)液中添加SBA極顯著地降低了細胞中Na+，K+-ATP酶活力，說明SBA可能促進了鯉魚腸道上皮細胞的凋亡。從本試驗細胞形態(tài)學觀察來看，培養(yǎng)液中加入SBA后，觀察到較多死細胞殘骸漂浮于培養(yǎng)液液面，細胞輪廓與對照組相比顯得不夠清晰，并發(fā)現(xiàn)個別細胞出現(xiàn)腫脹，說明SBA的添加增加了死亡細胞數(shù)量，可能促進了細胞的凋亡。

3.3 SBA對鯉魚腸道上皮細胞蛋白質代謝的影響

氨是動物體內蛋白質代謝中氨基酸脫氨基的主要產物［13］。本試驗結果表明，SBA導致鯉魚腸道上皮細胞培養(yǎng)液中氨濃度顯著增加，說明SBA促進鯉魚腸道上皮細胞增殖的同時，蛋白質在細胞內用于脫氨代謝途徑的量相對增加，進而使得蛋白質分解產生的氨基酸中以碳源或氮源直接參與新的蛋白質合成的量相對減少。細胞中GPT存在于胞質中，是氨基酸分解代謝的關鍵酶［13］。本試驗結果顯示，SBA增加了鯉魚腸道上皮細胞GPT活力，說明SBA增加了鯉魚腸道上皮細胞中蛋白質的分解代謝，且隨著SBA添加量的增加，蛋白質的分解代謝強度增加。細胞中GOT存在于動物細胞的線粒體中，是氨基酸分解代謝中催化轉氨基作用的重要酶［13］。本試驗結果顯示，SBA提高了鯉魚腸道上皮細胞GOT活力，且隨著SBA含量增加，細胞GOT活力逐漸增加，進一步說明了SBA的添加增強了鯉魚腸道上皮細胞氨基酸的分解代謝。同時，本試驗結果發(fā)現(xiàn)，SBA的添加量顯著增加了細胞中的蛋白質含量。這可能與鯉魚腸道內皮細胞的代償性增殖有關。上述結果表明，隨著處理中SBA添加量的增加，細胞氨基酸代謝強度也相應增加，SBA引起的氨基酸代謝增強可能是一種代償性行為，在動物生產中極有可能造成蛋白質的浪費。

4 結論

①SBA破壞了鯉魚腸道上皮細胞結構的完整性。

②SBA促進了鯉魚腸道上皮細胞的增殖和凋亡，但抑制了細胞的成熟分化。

③SBA影響了鯉魚腸道上皮細胞的蛋白質代謝強度。

［1］ RüDIGER H.Structure and function of plant lectin［C］//GZBIUS H J，GABIUS S.Glycosciences.Weinheim:Chapman and Hall，1997:415-427.

［2］ 李振田.大豆凝集素的檢測、純化和對大鼠的抗營養(yǎng)作用機理研究［D］.博士學位論文.北京:中國農業(yè)大學，2003:41-50.

［3］ MAK IND M O，UMAPATHY E，AKINGBEM B T I，et al.Effects of dietary soybean and cowpea on gut morphology and faecal composition in creep and non creep fed pigs［J］.Journal of the Animal American Veterinary Medical Association，1996，43:75-85.

［4］ BUTTLE L G，BURRELLS A C，GOOD JE，et al.The binding of soybean agglutinin(SBA)to the intestinal epithelium of Atlantic salmon，Salmo salar and rainbow trout，Oncorhynchusmykiss，fed high levels of soybeanmeal［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2001，80:237-244.

［5］ 樓允東.組織與胚胎學［M］.北京:中國農業(yè)出版社，1994:123-142.

［6］ 姜俊.谷氨酰胺對鯉魚腸上皮細胞生長和代謝的影響［D］.碩士學位論文.雅安:四川農業(yè)大學，2005:12-17.

［7］ BURRELLS C，W ILLIAMS P D，SOUTHGATE P J，et al.Immunological，physiological and pathological responses of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)to increasing dietary concentrations of soybean proteins［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，1999，72:277-288.

［8］ GRANT G，EWEN SW B，BARODOCZ S，et al.Local(gut)and system ic responses of rats to dietary soybean(Glycinemax)proteins:proceeding of Second InternationalW orkshop on Antinutritional Factors in Legumes Seeds，Wageningen，The Netherlands，23-25 November，1988［C］.［S.l］:［s.n.］，1989:34-38.

［9］ GRANT G，WATTW B，STEWARED JC S，etal.Effects of dietary soybean(Glycine max)lectin and trypsin inhibitors upon the pancreas of rat［J］.Medicinal Science Research，1987a，15:1197-1198.

［10］ JORDINSON M R A，GOODLAD A B，BLISSP，et al.Gastrointestinal responses to a panel of lectins in rats maintained on total parenteral nutrition［J］.A-merican Journal of Physiological，1999，276:1235-1242.

［11］ ALICE C， ZHANG R. Glutam ine reduces heat shock-induced cell death in rat intestinal epithelial cells［J］.Journal of Nutrition，1998，128:1296-1301.

［12］ TAKESHI Y，SHUNJI K，KAZUHIRO A，et al.Acid-labile ATP and/or ADP/Pibinding to the tetraprotomeric form of Na/K-ATPase accompanying catalytic phosphorylation-dephosphorylation cycle［J］.Journal of Biology Chem istry，1999，274:3179-

3182.

［13］ 周順武.動物生物化學［M］.北京:中國農業(yè)出版社，1999:149-157.