賀丹艷 羅永發(fā)

1 前言

以植物性飼料為主的配合飼料，其原料中往往含有較多的非淀粉多糖（NSP），尤其是谷類作物及其副產(chǎn)品。而對于單胃動物而言，其消化道缺乏消化NSP的酶，因此，此類物質被認為是一種重要的抗營養(yǎng)因子。阿拉伯木聚糖是小麥類飼料中的主要NSP，其可以通過結合大量的水分（Geissmann等，1973）增加消化道食糜的粘性，降低食糜混合均勻性、飼料通過速率和腸道氧化作用，從而造成微生物大量繁殖并在小腸中發(fā)酵（Preston等，2001）。為了消除木聚糖的抗營養(yǎng)作用，木聚糖降解酶被廣泛應用于生產(chǎn)，尤其是在國外，木聚糖酶的生產(chǎn)已比較成熟。文中在前人研究的基礎上綜述了木聚糖酶生產(chǎn)工藝的最新研究進展、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及其分子改造手段，以期為木聚糖酶的生產(chǎn)、性能優(yōu)化提供一些參考。

2 木聚糖酶的生產(chǎn)工藝

2.1 木聚糖酶

木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。糖苷鍵的徹底水解需要一系列主鏈和支鏈酶的共同作用，內切－1,4－β－木聚糖酶（EC 3.2.1.8），β－木糖苷酶（EC 3.2.1.37）和外切－1,4－β－木聚糖酶是降解主鏈最主要的酶（Paula Sá－Pereira等，2003）。內切－1,4－β－木聚糖酶以內切方式作用于木聚糖主鏈內部的β－1,4－木糖苷鍵，使木聚糖降解為短鏈的低聚糖；β－木糖苷酶是外切糖苷酶，通過催化低聚木糖的還原末端來釋放木糖殘基（Motoki Wakiyama等，2010）。外切－1,4－β－木聚糖酶（EC3.2.1.92），主要作用于木聚糖和木寡糖的非還原端，產(chǎn)物為木糖。木聚糖的結構及酶作用位點如圖1所示（Joselena，1992）。

圖1 木聚糖的結構及酶作用位點

另外，根據(jù)氨基酸序列相似度，可將木聚糖酶分為F/10家族和G/11家族。F/10家族分子量高（＞30 kDa），等電點低，G/11家族分子量低（19～25 kDa），等電點高。與G/11家族相比，F(xiàn)/10家族有更好的催化功能和較低的底物特異性（P.Biely等，1997）。

2.2 產(chǎn)酶菌種

近年來，多種木聚糖酶陸續(xù)從微生物中被分離出來，其中包括細菌、放線菌、真菌以及某些酵母（Sunna等,1997）。多數(shù)細菌和真菌分泌胞外木聚糖酶，將木聚糖水解為單糖，單糖再進入微生物細胞供代謝用。也有一些微生物如瘤胃細菌、嗜飽粘液球菌及黑曲霉中的一些種類，也產(chǎn)生胞內酶（周秀梅，2008）。真菌木聚糖酶的活性通常要高于細菌木聚糖酶（陸健等，2001），細菌產(chǎn)生的木聚糖酶的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性比真菌高，最適作用溫度通常與產(chǎn)酶微生物的最適生長溫度成正向相關。絲狀真菌如曲霉屬（Aspergillus sp.）和木霉屬（Trichodermasp.），由于能分泌胞外木聚糖酶，且產(chǎn)酶水平高于酵母菌和細菌而格外引起研究人員的關注（Fang等，2007），但是絲狀真菌產(chǎn)生木聚糖酶時往往伴隨著纖維素酶的產(chǎn)生。一些桿菌和真菌微生物可以產(chǎn)生無纖維素酶活性的木聚糖酶（陸健等，2001）。

2.3 微生物發(fā)酵生產(chǎn)

目前木聚糖酶的生產(chǎn)主要依靠真菌、細菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)。按照發(fā)酵工藝的不同可分為固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。固態(tài)發(fā)酵（SSF）是指微生物在無流動水的潮濕基質上生長，SSF的優(yōu)點是產(chǎn)物回收的液體需求量少，底物便宜，培養(yǎng)成本低等（Q.K.Beg等，2001），但不易控制，酶系復雜，纖維素等酶含量高，難以精酶化。目前國內普遍采用固態(tài)發(fā)酵。液體發(fā)酵具有如下特點：①在液態(tài)環(huán)境中，菌體、底物、產(chǎn)物(包括熱量)易于擴散，使發(fā)酵在均質或擬均質條件下進行，便于檢測、控制，容易擴大生產(chǎn)規(guī)模；②液體輸送方便，易于機械化操作；③產(chǎn)品易于提取精制。但缺點是對設備的要求較高，成本高，技術要求也較嚴格(Garjek W，1987；Roche N 等，1994)。

2.4 木聚糖酶的分離、純化

木聚糖酶分離純化的一般步驟是粗酶預處理、粗酶沉淀、色譜分離。純化的早期步驟通常使用低分辨率、非專一性的粗分離純化手段，如硫酸銨鹽析、超濾、透析等以達到濃縮、去除大部分雜質和色素的目的；隨后常用的色譜有離子交換、凝膠過濾、疏水色譜、親和色譜和色譜聚焦（周玉恒等，2005）。

2.4.1 傳統(tǒng)的非特異性分離

傳統(tǒng)的非特異性分離方法一般包括硫酸銨沉淀、超濾濃縮、離子交換層析和凝膠過濾層析。

硫酸銨沉淀是酶分離純化中常用的方法,可以同時達到濃縮與粗分離的目的。Gashaw等（2006）將從Bacillus halodurans S7獲得的內切-1,4-β-木聚糖酶（分子量為43 kDa）粗酶液進行硫酸銨鹽析，回收率為66.5%,并將比活從8.9 U/mg提高到了13.2 U/mg。但對于低分子量木聚糖酶的純化來說，可能是限制其回收率的主要因素。Paula S.P.等（2002）在純化Bacillus subtilis的XylⅡ時，發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀這一步使酶的回收率降低了62%，并且其它的濃縮方法回收率也不高。

在一定的條件下，采用不同切割分子量的超濾柱對木聚糖酶進行分級分離，可對木聚糖酶起到一定的分離精制作用（劉蕾等，2010）。Puji Rahayu等（2010）從Bacillus sp.AQ-1中分離木聚糖酶，采用切割分子量為30 kDa的聚醚砜膜進行超濾,分離出了大小分別為15.7 kDa和57.7 kDa的木聚糖酶A和木聚糖酶B。采用超濾方法有時會造成目的酶的大量損失，可能與酶的結構或者膜孔的分布不均有關。同時，目的木聚糖酶結構中如果含有纖維素結合區(qū)時，膜材料最好不要選擇纖維素膜,因為由于木聚糖酶與膜的吸附作用可能造成大量損失（孫雷等，2005）。

離子交換層析技術是木聚糖酶分離純化中常采用的方法。根據(jù)目的酶的等電點選擇合適的分離樹脂，對于弱酸性及中性的木聚糖酶多采用陰離子交換樹脂，如 DEAE-Toyopearl 650S（Motoki Wakiyama 等，2010）；對于弱堿性的木聚糖酶多采用陽離子交換樹脂，如 DEAE-Sepharose CL-6B（Fang 等，2008）。Ashwani等（2010）在分離Bacillus subtilis ash的木聚糖酶時，采用CM-Sephadex C-50離子交換一步法，回收率為 43%，純化倍數(shù)為 10.5。Suchita Ninawe等（2008）將Streptomyces cyaneus SN32產(chǎn)生的木聚糖酶粗酶液經(jīng)過硫酸銨沉淀后，再用DEAE Sepharose進行離子交換，得到的產(chǎn)物回收率為43.62%，純化倍數(shù)為2.254。

凝膠過濾是一種根據(jù)分子大小不同分離純化木聚糖酶的常用分離方法之一。經(jīng)過凝膠過濾層析后木聚糖酶的回收率一般都較低，這可能由于木聚糖酶結構中含有纖維素結合區(qū) (Cellulose-Binding Domain，CBD)，而葡聚糖是由α-葡萄糖殘基構成的，兩者可以相互結合（孫雷等，2005）。Wang等（2010）將 Bacillus sp.NTU-06產(chǎn)生的木聚糖酶經(jīng)過離子交換，然后將活性部分注入Sephadex G-200凝膠，結果回收率為16.1%，純化倍數(shù)為36.7，并且凝膠SDS-PAGE電泳后，得到的條帶顏色變淺，這是由于活性木聚糖酶使凝膠中的木聚糖基質發(fā)生水解。

2.4.2 特異性分離純化

應用特異性步驟分離純化木聚糖酶，一是利用木聚糖酶自身結構上可以與多糖結合的能力。另外，是利用基因技術使木聚糖酶結構中帶有親和標記（孫雷等，2005）。這些特異性分離純化方法主要有與多糖特異性結合親和層析、雙水相萃取、三相分離等。

除了催化區(qū)，一些木聚糖酶還含有非催化區(qū)即糖類結合域（carbohydrate-binding module，CBM），CBM可以提高木聚糖酶與不溶性基質結合的能力（Liu等，2010）。CBM主要包括纖維素結合域CBD（cellulosebinding domain）和木聚糖結合域XBD(Xylan-Binding Domain)。CBD可專一地吸附于可溶或不可溶的纖維素上。一些CBD不可逆地結合在纖維素上，此類CBD可用于固定化。具有此CBD的木聚糖酶或者含此CBD標簽的酶可固定到纖維素上。另一些CBD可逆結合到纖維素上，可作為一種親和標簽，在分離和純化上更為有用（周玉恒等，2005）。木聚糖酶中的XBD較CBD而言較少存在，其原因可能是木聚糖多聚物中帶有許多類型的取代基，由于取代基的變化從而使能夠結合所有木聚糖蛋白區(qū)域的進化成為不可能(BlackG.w 等，1995)。

雙水相系統(tǒng)（Aqueous Two-Phase System,ATPS）主要是通過混合兩種低濃度的不相溶高聚物溶液或者一種高聚物溶液和一種鹽溶液形成。ATPS系統(tǒng)分離的基礎是兩相之間物質的選擇性分配，由與相位系統(tǒng)特征相關的一系列參數(shù)和物質以及他們的相互作用控制（Albertsson，1986）。與其他分離純化相比，由于ATPS系統(tǒng)的含水量高，處理時間短，能量消耗低，所以其具有更好的生物兼容性（Andersson等，1990）。Yang等（2008）利用聚乙二醇（PEG）/硫酸銨系統(tǒng)純化來自嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的一耐熱木聚糖酶，研究了6個包含不同的PEG分子量、硫酸銨濃度的ATP系統(tǒng)，結果在pH值7.2、12.5%PEG-4000、25%硫酸銨和50%酶溶液時最優(yōu)，回收率為98.7%，純化倍數(shù)為5.54。

三相系統(tǒng)與ATPS不同，即在上下相之間有一界面相，一般由蛋白質水溶液中加入一種鹽（一般是硫酸銨）和一種有機溶劑（一般是t-丁醇）形成(Dennison等，1997)。Ipsita等（2004）先將 Aspergillus niger木聚糖酶用8 mol/l尿素和100 mmol/l二硫蘇糖醇變性，再進行TPP純化，木聚糖酶達到了93%的回收率和21倍純化，且實現(xiàn)了該酶變性后的復性。

除了上面的技術外，Everaldo Silvino Dos Santos等（2002）曾嘗試用擴張床吸附技術（Expanded bed adsorption，EBD）純化木聚糖酶，雖然最大只有30倍的純化和21.8%的回收，但此法具有既經(jīng)濟又省時，木聚糖酶發(fā)酵液不需沉淀澄清的優(yōu)點。

3 木聚糖酶的優(yōu)化

3.1 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

3.1.1 篩選菌株

要提高木聚糖酶的活力及性能，第一步就是要篩選出高產(chǎn)菌株和特異性菌株（如耐熱性能好、pH值適應范圍廣等）。

3.1.1.1 自然選育

自然選育是指對微生物細胞群體不經(jīng)過人工處理而直接進行篩選的育種方法。虢國成（2008）利用透明圈比較法和DNS法相結合，篩選出26株產(chǎn)木聚糖酶菌，并從中分離、純化出一株高產(chǎn)木聚糖酶菌-S6。代義等（2008）以半纖維素、樺木木聚糖為唯一碳源，兩步透明圈法從10種混合土壤樣品中，分離到一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株HJ-04，通過形態(tài)學觀察、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鑒定為短小芽孢桿菌。趙峰等（2008）采用木聚糖為唯一碳源的平板初篩培養(yǎng)基以及搖瓶復篩液體培養(yǎng)基，從保藏的菌株中篩選到產(chǎn)木聚糖酶活力較高、菌絲生長快的粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)菌株。另外，已報道的耐熱真菌有嗜熱毛殼菌（Humicola insolens）、特異腐質霉（Humicola insolens）、嗜熱羊毛狀腐質霉(Humicola lanuginosa)、灰色腐質霉（Humicola grisea）、嗜熱擬青霉（Melanocarpus albomyces）、埃默森籃狀菌（Talaromyces emersonii）、絲衣霉狀籃狀菌（Talaromyces byssochlamydoides）、疏綿狀嗜熱絲胞菌 (Thermomyces lanuginosus)、耐熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)等。

3.1.1.2 人工誘變

關于高產(chǎn)菌株的篩選目前已有很多報道，人工誘發(fā)基因突變是主要改良途徑之一。徐同寶等（2009）以黑曲霉 (Aspergillus niger)XE6為出發(fā)菌株，經(jīng)微波(MW)和硫酸二乙酯(DES)誘變處理,選育出一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)木聚糖酶菌株mAn1。周欣等（2009）以短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)HJ-04為出發(fā)菌株,通過紫外誘變的方法篩選得到一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株B-6，其酶活提高約30%。劉喚明等（2008）以木聚糖酶酶活為20000 U/g的黑曲霉P14為出發(fā)菌株，通過離子注入誘變，得到產(chǎn)木聚糖酶酶活32000 U/g的菌株L15。

3.1.1.3 構建基因工程菌

微生物產(chǎn)生木聚糖降解酶系比較復雜，大多還同時產(chǎn)生纖維素酶，這些酶性相近，使分離純化木聚糖酶比較困難，利用基因重組技術，將產(chǎn)生木聚糖酶的基因在合適的宿主菌中表達，可比較容易地得到純化。Panbangred和Fukusaki（1985）首次利用大腸桿菌表達矮小芽孢桿菌（Bacillus.pumilus IOP）β-木聚糖酶。隨后已有數(shù)十種不同來源的木聚糖酶基因在原核生物表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了表達。Wang等（2010）將從Anoxybacillus sp.E2中克隆的木聚糖酶基因xynE2導入大腸桿菌BL21(DE3)中表達，純化后得到的重組XynE2在pH值6.6～8.6范圍內能保持最大活力的90%，在pH值4.6～12.0的范圍內仍能保持80%的活力1 h。Qiu等（2010）從Streptomyces megasporus DSM 41476基因文庫中篩選出xynAM6基因，并在畢赤酵母GS115中成功表達其成熟肽，結果表明，該酶溫度適應范圍廣（50～80℃范圍內能保持最大活力的60%），并在60℃和70℃時有良好的熱穩(wěn)定性，在pH值4.0～11.0范圍內保持穩(wěn)定。

3.1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.1.2.1 選擇合適的誘導物

由細菌和真菌產(chǎn)生的木聚糖酶通常是誘導型的，但也有很少一部分木聚糖酶是組成型的。木聚糖作為高分子的多聚物不能夠透過細胞壁，在少量組成型酶的作用下釋放出低聚糖碎片，這些碎片包括木糖、木二糖、低聚木糖等（Bastawde，1992）。其作用機制見圖2(Polizeli等，2005)。

圖2 木聚糖酶的作用機制

當單糖如木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖等作為唯一碳源時，一般都不發(fā)揮誘導作用，而且由葡萄糖引起的代謝阻遏是木聚糖酶生物合成中的普遍現(xiàn)象。在海棗曲霉(Aspergillusphoenicis)中，由木聚糖、木糖和β-甲基木糖苷誘發(fā)的木聚糖酶活性主要是胞外的，向木聚糖或者木糖基質中加入1%的葡萄糖抑制木聚糖酶的表達，但這種抑制可以通過添加cAMP或者聯(lián)丁酰cAMP 得到緩解 （Ana等，2008）；Kohji Miyazaki等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，對于布氏普雷沃氏菌B14(Prevotella bryantii B14)，木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木戊糖、樹膠醛糖、葡萄糖醛酸皆不能誘導其產(chǎn)生木聚糖酶，并且當葡萄糖水平達到0.1%（w/v）時即會產(chǎn)生代謝阻遏或者誘導排斥，從而造成木聚糖酶表達的延遲。

一般來講，木聚糖酶的誘導是復雜的，其誘導水平也因微生物的不同而相差較大，對于某一種微生物可以產(chǎn)生最大木聚糖酶活性的誘導物可能是另外一種微生物產(chǎn)木聚糖酶的抑制劑。在白腐真菌粗毛栓菌（Trametes trogii）(Levin 等，1998)、 泡盛曲霉（Aspergillus awamori）(Siedenberg 等，1998)、鏈霉菌sp.QG-11-3(Beg等，2000)中誘導物一般是木聚糖，而在黃纖維單胞菌（Cellulomonas flavigena)(Avalos等，1996)中木聚糖的誘導效果則不好。β-D吡喃木精基可以作為木聚糖酶組的誘導物 (Ghosh等，1994；Rizzatti等，2001)，但在一些微生物中它將導致內切木聚糖酶的代謝阻遏(Flores等，1996；Mach 等，1996)。另外，木聚糖酶的其他一些誘導物如L-山梨糖、各種木寡糖、木質纖維素殘渣等都有過報道。

3.1.2.2 選擇合適的氮源

氮源是構成細胞原生質和酶蛋白的主要原料，因此對微生物的生長和酶的合成也會有所影響。據(jù)Haapala等（1996）研究表明，以固定化里氏木霉QM 6a制備木聚糖酶時，氮源對產(chǎn)酶的影響比pH值更為重要。一般來說，單一物質作氮源時有機氮源優(yōu)于無機氮源。Sushil等（2010）以短小芽孢桿菌SV-85S（Bacillus pumilus SV-85S）為出發(fā)菌株，以1.0%的小麥麩為碳源，研究蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、以及硝酸鉀、硫酸銨、硝酸鈉對木聚糖酶活性的影響，結果表明，添加有機氮源時酶的滴定度更高，另外，不同氮源的組合效應表明，蛋白胨、酵母提取物和硝酸鉀組合時酶的產(chǎn)量最高；對于環(huán)狀芽孢桿菌AB16（B.circulans AB16）和喜熱噬油芽孢桿菌 (Geobacillus thermoleovorans)而言，最好的氮源則是胰蛋白胨。盡管如此，但也有一些研究結果得出無機氮源和有機氮源的效果無顯著差異，或者無機氮源優(yōu)于有機氮源。在苜蓿根腐病菌F7（Fusarium solani F7）的培養(yǎng)基中分別以蛋白胨、尿素、酵母提取物、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨和牛肉膏為氮源，結果表明，蛋白胨和硝酸鈉的效果最好，并且硝酸銨和尿素也能產(chǎn)生相當數(shù)量的木聚糖酶（Gupta等，2009）；短小芽孢桿菌HJ-04(Bacillus pumilus HJ-04)NH4NO3最利于產(chǎn)酶，總體是無機氮源比有機氮源更利于HJ-04產(chǎn)酶（代義等，2008）。黑曲霉 (Aspergillus niger)XE6以NH4NO3為氮源時菌株的產(chǎn)酶活性顯著高于其它氮源（徐同寶等，2009）。

3.1.2.3 固定化

在實際應用中，將微生物或者酶固定在固態(tài)材料上具有許多優(yōu)點，包括酶的重復利用、易于產(chǎn)品分離、提高酶的穩(wěn)定性等。在固定化研究中，可把微生物的整個細胞固定在支持物上，酶本身也可固定在某些可溶或不溶的聚合物上（Beg等，2001）。為此，選擇合適的技術和支持物是非常必要的。在大多數(shù)已知的載體中，明膠和殼聚糖通常比較理想，因為它們生物兼容性好并且無毒（Achouri等，2009）。在 Manrich等（2010）的研究中，將木聚糖酶固定在環(huán)氧殼聚糖上，固定率達到100%，并且能保留64%的酶活，而將其固定在乙醛瓊脂糖上時，固定率和穩(wěn)定性都較差。Mohamed Guerfali等（2009）發(fā)現(xiàn)，與其他支持物相比，將嗜熱踝節(jié)菌（Talaromyces thermophilus）的 β-木糖苷酶固定在用戊二醛處理的殼聚糖上時，固定率和酶活均最高，分別達到94%和87%，并且在循環(huán)25次后仍能保留最初酶活的94%。另外，與游離酶相比，固定酶的熱穩(wěn)定性提高了，固定酶在pH值8.0和53℃時達到最大活力，而游離酶達到最大活力的pH值和溫度分別為7.0和50℃。已知報道過的固定化材料還有海藻酸鈉（Sanjay Kar等，2008）、聚氨基甲酸乙酯泡膜（PUF）（Uma Gupta等，2008）、米碳管（Shweta Shah等，2008）、Eudragit L-100（周玉恒等，2007）、尼龍布（Haapala，1996）等。

除了固定化材料的固有性質外，對其進行適當修飾也可改善其性能。支持物與酶之間的共價鍵數(shù)量由支持物的活化度（支持物表面的醛基數(shù)目）和酶分子的氨基數(shù)目決定(J.M.Guisán，1988)，可以通過增加酶分子表面的氨基數(shù)目來提高固定化酶的性能。Manrich等（2010）將木聚糖酶固定在乙醛瓊脂糖上時，固定率和穩(wěn)定性都較差，這主要是因為酶分子的賴氨酸基團的數(shù)目較低，最后經(jīng)過乙二胺修飾，酶的穩(wěn)定性提高了40倍，并且固定率達到了100%。

盡管固體支持物有很多優(yōu)點，但一些缺點還是不可避免的，比如木聚糖基質的固態(tài)性能會限制酶的通過，并且由于結合酶不易與大體積的不溶性基質接觸，使木聚糖酶的效率有可能降低。為了克服這點，有些學者提出了一種新的酶固定化技術，即基于人工油體（AOBs）的表達/純化系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，種子油體的一種獨特的結構蛋白油脂蛋白被作為載體，油脂蛋白的親脂部分嵌入三酰甘油中，兩個兩性手臂突出于油體表面，從而，目標蛋白可以融合到油脂蛋白的N或者C末端形成不溶性重組蛋白，而后在大腸桿菌中表達（Hung等，2008）。

3.2 木聚糖酶的分子改造

大多數(shù)天然酶的活力較低，而且催化特性也往往不能滿足人們的需求，因此對酶分子進行改造具有十分重要的意義。幾十年來對酶分子的改造工作可以歸納為以下幾個方面：酶的化學修飾、定點突變、雜合進化和定向進化等。

3.2.1 定點突變

酶本身的一級結構對其耐熱性具有重要作用。酶的一級結構中某些關鍵區(qū)域的個別氨基酸改變，就會引起高級結構的變化，使酶蛋白結構中的氫鍵、離子鍵或疏水鍵稍有增加，從而提高整個分子的熱穩(wěn)定性（連惠薌，2009）。Zhang等（2010）將來自嗜溫菌橄欖灰綠鏈霉菌 (Streptomyces olivaceovirdis)的木聚糖酶SoxB的N末端第33位氨基酸殘基用來自嗜熱菌以褐色高溫單胞菌（Thermomonospora fusca）的木聚糖酶TfxA相應殘基取代，發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性大大提高。Kim等（2010）研究表明，Cohnella laeviribosi HY-21產(chǎn)生的木聚糖酶iXylc的色氨酸W89A突變使其對PNP-吡喃木糖基的催化活性提高了3.4倍，而W217A和W315A突變則使其催化活性提高了大約8.3倍。

3.2.2 定向進化

酶的體外定向進化，又稱分子進化，就是人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、重組和自然選擇），在體外對酶基因進行隨機誘變，用一定的篩選或選擇方法定向選出所需性質的突變酶。目前已發(fā)展出多種定向進化的策略，如易錯PCR(erro-prone PCR)、DNA 重排(DNA shuffling)、體外隨機引發(fā)重組（random-priming in vitro recombination，PRP)、交錯延伸(stagger extension process，StEP)等（連惠薌，2009）。表1列出了一些木聚糖酶體外定向進化的成功實例。

表1 木聚糖酶體外定向進化的成功實例

4 結語

國外對木聚糖酶的研究較早，在1992年就已經(jīng)實現(xiàn)了酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)（Senior等，1992）。隨著分子生物學的發(fā)展和眾多新的試驗方法的引入，對木聚糖酶的研究已經(jīng)達到了分子生物學基因工程的水平。國內對木聚糖酶的研究起步較晚，作為一種工業(yè)酶制劑在我國尚屬空白。雖然木聚糖酶在眾多的領域都有極大的應用價值，其研究也取得了一定的進展，但目前仍然存在著一些缺點，如穩(wěn)定性差、使用效率低、半衰期短等，使酶的生產(chǎn)和使用受到極大限制。今后需從以下幾個方面來改造木聚糖酶，以拓寬木聚糖酶的應用范圍：①木聚糖酶的耐熱性一般不好，在生產(chǎn)和處理過程中穩(wěn)定化技術研究是今后研究方向之一，可以考慮通過包被等方法加以解決；②運用基因工程手段從根本上改善木聚糖酶的性質，使其具有更高的熱穩(wěn)定性，并拓寬其pH值適應范圍等；③尋找更多的產(chǎn)酶優(yōu)化手段，來高效地生產(chǎn)高活力的木聚糖酶。