王玲 張春曉 孫鳴 溫俊

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，是我國養(yǎng)殖量最大，產(chǎn)業(yè)化程度最高的養(yǎng)殖對蝦品種。然而在集約化養(yǎng)殖過程中，由于密度高、水質交換差以及環(huán)境因素不穩(wěn)定導致對蝦生長慢且病害頻發(fā)。為提高生長速度、防治病害，各種化學藥物廣泛應用，由此引發(fā)社會對養(yǎng)殖對蝦食品安全的憂慮，因此亟需研發(fā)能替代化學藥品且綠色安全的添加劑。

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用已越來越受到廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的關注。已有研究報道，益生菌可顯著增強水產(chǎn)動物消化道消化酶活力，提高對飼料的表觀消化率，同時還可降低養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫等有害物質，從而優(yōu)化養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，提高了養(yǎng)殖生物的成活率、生長速率和抗病能力[1]。并且益生菌具備對水產(chǎn)動物無毒害、對食品安全無威脅、對環(huán)境無污染等特點，是一類高效的綠色飼料添加劑。

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用的飼用益生菌主要有光合細菌、芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌）[2－3]、酵母菌[4]（Surawicz等，1989）和乳酸菌（嗜酸乳酸菌和雙歧桿菌）[5－6]。其中，枯草芽孢桿菌可以以內孢子的形式存在，對高溫、高壓、氧化等不良環(huán)境的抵抗力很強，能夠耐受水產(chǎn)飼料的加工條件，并且可耐受胃中的強酸性環(huán)境，其在腸道繁殖時分泌的大量蛋白酶及其他酶類能降解營養(yǎng)物質，有助于宿主對營養(yǎng)物質的吸收利用[7－8]。丁賢等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，向飼料中添加芽孢桿菌可以顯著提高凡納濱對蝦消化道蛋白酶和淀粉酶活力，并可提高對蝦的生長性能[1]。Lin等（2004）發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可以提高凡納濱對蝦對飼料的消化率[9]。Rengpipat等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦攝食含芽孢桿菌（S11）的飼料后，其免疫力和抗病力顯著提高[10]。本試驗的目的是通過向高魚粉和低魚粉飼料中添加不同水平的枯草芽孢桿菌（B.S.3755）以評估其對凡納濱對蝦生長性能和非特異性免疫力的影響，為枯草芽孢桿菌（B.S.3755）在凡納濱對蝦飼料中的應用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗飼料

以魚粉、豆粕和菜籽粕為主要蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，小麥面粉為主要糖源，并補充無機鹽、維生素等配制出基礎飼料。向基礎飼料中分別添加0、600和1200 mg/kg的枯草芽孢桿菌（B.S.3755；該菌種由北京都潤科技有限公司提供，枯草芽孢桿菌含菌量為2.0×109cfu/g），另外，以植物蛋白替代基礎飼料中3.5%的魚粉蛋白配制低魚粉飼料，并向飼料中分別添加600和1200 mg/kg的B.S.3755，共配制成5種等氮、等能的實驗飼料（見表1），進行攝食生長實驗。

各種實驗飼料原料經(jīng)粉碎，過80目篩網(wǎng)，按配比稱量后混合均勻，然后加入適量的水揉勻，經(jīng)雙螺桿制粒機（CD4×1TS多功能催化劑成型機）加工成1.5×2.0 mm的顆粒狀飼料，并于80℃烘干至飼料水分含量為10%左右，于-20℃冰箱保存，備用。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)水平（%）

1.2 實驗過程

養(yǎng)殖實驗在集美大學水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗場中進行。正式實驗前，凡納濱對蝦暫養(yǎng)于兩個1000 L的水族箱中，以實驗基礎飼料投喂2周，待其適應實驗飼料后，對實驗蝦禁食24 h，然后選擇健康、體重相似的幼蝦（2.03±0.01）g，隨機放入20個實驗水族箱（約120 L水體）中，每箱放養(yǎng)30尾蝦，每種飼料隨機投喂4組實驗蝦。每天投喂 2 次（8：00，17：00），達飽足。實驗為期8周。實驗期間，每天清除殘餌和糞便并記錄攝食量和蝦健康狀況。實驗用水為經(jīng)砂濾后的天然海水，鹽度27～30‰左右，養(yǎng)殖全過程不間斷充氣。實驗期間水溫25～28℃，pH值為7.9～8.2，溶解氧約為6 mg/l。每天投喂前排污一次，每次換水占總水量的20%左右，每天觀察對蝦的攝食、游動、蛻殼及死亡情況。

實驗結束時，將實驗蝦禁食24 h，以丁香油（1：10000）麻醉，然后計數(shù)，稱重。分別從每網(wǎng)箱隨機抽取10尾麻醉的實驗蝦，以1 ml無菌注射器自頭胸甲后緣的圍心竇內取血。以1.5 ml離心管封存，放入4℃冰箱中，待其凝血后4℃離心分離血清，用于血清酸性磷酸酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶和酚氧化物酶活力的測定。

1.3 樣品分析測定方法

1.3.1 常規(guī)分析

采用凱氏定氮法測定飼料粗蛋白含量；采用索氏抽提法，以乙醚為抽提劑測定粗脂肪含量；將樣品在電爐上炭化后，在馬福爐中灼燒(550℃)8 h后測得樣品灰分含量[11]。

1.3.2 酶活力測定

1.3.2.1 酸性磷酸酶（ACP）活力測定

采用南京建成生物工程研究所提供的酸性磷酸酶測試盒，方法參照其說明書。ACP活力定義：100 ml血清在37℃與基質作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位（U/100 ml）。

1.3.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力測定

采用南京建成生物工程研究所提供的超氧化物歧化酶測試盒，方法參照其說明書。SOD總活力定義：每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD的量為1個亞硝酸鹽單位（NU/ml）。

1.3.2.3 過氧化物酶（POD）活力測定

采用南京建成生物工程研究所提供的過氧化物酶測試盒，方法參照其說明書。POD活力定義：在37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1 μg的底物酶量定義為一個酶活力單位（U/ml）。

1.3.2.4 酚氧化酶（PO）活力測定

以 L－dopa 為底物，采用改進的 Ashida（1971）[12]方法，按以下步驟進行測定：于96孔酶標板中，將300 μl的 0.1 mol/l、pH值 6.0的磷酸鉀鹽緩沖液與 10 μl 0.01 mol/l的 L－dopa 及 10 μl血清于室溫下混勻，之后置于酶標儀中，固定吸收波長490 nm，按照每4 min測量1次，連續(xù)測量5次，測其血清酶動力學OD值。以OD490對反應時間作圖，以實驗條件下每分鐘OD值增加0.001定義為1個酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和計算方法

成活率(%)=成活尾數(shù)/總尾數(shù)×100；

增重率(%)=[終末平均體重（g）－初始平均體重（g）]/初始平均體重（g）×100；

飼料系數(shù)=攝食飼料量（g）/[終末體重（g）－初始體重（g）]。

采用SPSS 11.5 for Windows對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，若差異達顯著，則進行Tukey多重比較，顯著性水平為 P＜0.05。

2 實驗結果

2.1 飼料中添加B.S.3755對凡納濱對蝦生長性能的影響(見表 2）

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌（B.S.3755）對凡納濱對蝦生長性能的影響

實驗結果表明，各添加B.S.3755飼料組對蝦的成活率都高于基礎飼料組（D1組），但實驗各組間成活率沒有顯著差異（P＞0.05）。添加600和1200 mg/kg B.S.3755的高魚粉飼料組（D2和D3組）對蝦的增重率顯著高于D1組（P＜0.05），且兩個高魚粉組間增重率差異不顯著（P＞0.05）。添加 600和 1200 mg/kg B.S.3755的低魚粉飼料組（D4和D5組）對蝦的增重率高于D1組，低于 D2和 D3組，但其差異未達顯著水平（P＞0.05），且D4和D5組間的增重率也無顯著差異（P＞0.05）。飼料系數(shù)的變化規(guī)律與增重率相似，D2和D3組對蝦的飼料系數(shù)分別顯著低于D1組（P＜0.05），而D2和D3組間對蝦的飼料系數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。D4和D5組對蝦飼料系數(shù)低于D1組，高于D2和D3組，但差異未達顯著水平（P＞0.05），且D4和D5組間的飼料系數(shù)也無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 飼料中添加B.S.3755對凡納濱對蝦血清ACP、SOD、POD、PO 活力的影響（見表3）

添加B.S.3755的實驗組凡納濱對蝦血清ACP活力均高于D1組。其中D2組對蝦血清ACP活力顯著高于D1組（P＜0.05），而D3組對蝦血清ACP活力高于D1組但低于 D2組（P＞0.05），D4和D5組也出現(xiàn)相似的規(guī)律，即D4組顯著高于D1組，而D5組高于D1組而低于D4組，但差異未達顯著水平（P＞0.05）。并且添加B.S.3755的各組間 （D2、D3、D4和 D5）ACP 活力無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 飼料中添加枯草芽孢桿菌（B.S.3755）對凡納濱對蝦體液免疫因子的影響

隨著飼料中B.S.3755添加量的增加，對蝦血清SOD活力逐漸增加，最大值出現(xiàn)在D5組，其次是D3組，但實驗各組間SOD活力差異未達顯著水平（P＞0.05）。

添加B.S.3755的實驗組凡納濱對蝦血清POD活力均高于D1組，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。

添加B.S.3755的實驗組凡納濱對蝦血清PO活力均高于D1組。其中D2組對蝦血清PO活力高于D1組而低于D3組，但D1和D2組兩組之間差異不顯著（P＞0.05），而D1和D3組之間的差異達到顯著水平（P＜0.05）。D5組 PO 活力顯著高于 D1和 D2組（P＜0.05），但D5、D4和 D3組之間差異不顯著（P＞0.05），即高劑量 B.S.3755添加組（1200 mg/kg）（D3、D5組）的 PO 活力皆顯著高于 D1組（P＜0.05），而低劑量 B.S.3755添加組（600 mg/kg）（D2、D4組） 的 PO 活力與 D1組差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 飼料中添加B.S.3755對凡納濱對蝦生長性能的影響

已有研究表明，益生菌可顯著提高凡納濱對蝦[13]和草魚[14]等水產(chǎn)動物的成活率。本試驗中，實驗各組凡納濱對蝦成活率沒有顯著差異。這可能是因為凡納濱對蝦能很好地適應實驗環(huán)境，在實驗過程沒有發(fā)生病害，因而成活率較高（在90%以上），其抗病性能沒有得到充分體現(xiàn)。

在本試驗中，添加B.S.3755的高魚粉飼料組（D3組），對蝦的增重率顯著高于基礎飼料組（D1組），飼料系數(shù)顯著低于基礎飼料組（D1組）。這說明添加B.S.3755可提高動物對飼料營養(yǎng)物質的利用率。丁賢等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，向飼料中添加芽孢桿菌可以顯著提高凡納濱對蝦的生長性能，并可提高其消化道蛋白酶和淀粉酶活力[1]，相似的結果也在劉小剛等（2002）對異育銀鯽的研究中發(fā)現(xiàn)[15]。王福強等（2005）研究認為，益生菌能夠拮抗牙鲆腸道弧菌的生長，增加消化道消化酶的活力，促進腸道有益菌的生長繁殖，并能夠提高牙鲆的生長率[16]。而Lin等（2004）通過實驗證實了芽孢桿菌可以提高凡納濱對蝦對飼料的消化率。這說明益生菌可提高水產(chǎn)動物消化道消化酶活力，而酶活力的提高有助于動物對營養(yǎng)物質的消化[9]。溫?。?009）發(fā)現(xiàn)，草魚飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著降低草魚腸道弧菌總數(shù)，提高有益枯草芽孢桿菌總數(shù)，并且可提高草魚的生長性能[14]，說明枯草芽孢桿菌可以很好地在草魚腸道活化而起到益生作用。以上結果說明，芽孢桿菌進入動物腸道后萌發(fā)成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細菌，并可增強動物腸道的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，而酶活力的提高有助于飼料的消化，從而提高動物的生長性能和對飼料的利用率。本實驗中，D4組凡納濱對蝦的增重率與D1組相比沒有顯著差異（P＞0.05），表明在飼料中添加B.S.3755的條件下，可以以植物蛋白有效替代凡納濱對蝦飼料中3.5%的魚粉蛋白，說明添加B.S.3755可提高凡納濱對蝦對植物蛋白的消化和利用率，這可為凡納濱對蝦飼料中魚粉的有效替代提供新的途徑。

3.2 飼料中添加B.S.3755對凡納濱對蝦非特異性免疫力的影響

酸性磷酸酶（ACP）是動物體內巨噬細胞溶酶體的標志酶[17]，在體內直接參與磷酸基團的轉移和代謝，具有降解酶的作用，同時它還可以反映巨噬細胞被激活的程度[18]，因此，血清酸性磷酸酶常作為非特異性免疫力的標識。已有研究表明，飼料中添加肽聚糖和β－葡聚糖等免疫刺激物可顯著增強凡納濱對蝦血清的ACP活力[19－20]。本實驗中，飼料中添加B.S.3755組凡納濱對蝦的ACP活力高于對照組，其中D2和D4組凡納濱對蝦血清ACP活力顯著高于D1組。朱學芝等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦飼料中添加芽孢桿菌可顯著提高對蝦血清的ACP活力[21]，且降低了溶藻弧菌攻毒后的死亡率[13]，在文國等（2009）對凡納濱對蝦的研究報道中[22]也有相似結果，這與本試驗的結果一致，說明飼料中添加芽孢桿菌可能通過提高ACP活力而提高凡納濱對蝦的非特異性免疫力和抗病力。

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）同屬于抗氧化酶系，許多研究表明，過氧化物酶同工酶能夠反映生物體生長發(fā)育、體內代謝狀態(tài)以及外界環(huán)境脅迫的變化[23]。王秀華等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加肽聚糖不影響凡納濱對蝦血清的SOD活力[19]，文國等（2009）也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加芽孢桿菌和中草藥制劑對凡納濱對蝦血清SOD活力沒有顯著影響[22]，然而，飼料中添加β-葡聚糖則可顯著提高對蝦血清的SOD活力[20]。在本實驗中，飼料中添加600～1200 mg/kg B.S.3755對凡納濱對蝦血清SOD和POD活力沒有顯著影響。其原因一方面可能是實驗環(huán)境對實驗對蝦的脅迫較小或實驗蝦體內的氧化壓力不大，導致SOD變化不顯著；另一方面可能是不同免疫刺激物對對蝦非特異性免疫力的激活途徑存在差異。

研究已確認，甲殼類對異物識別等免疫反應起關鍵作用的是甲殼類動物血細胞內的酚氧化物酶原系統(tǒng)，該系統(tǒng)的成分被激活后可以促進血細胞的吞噬、介導凝集和凝固，產(chǎn)生殺菌物質等[24-26]。本實驗結果表明，飼料中添加1200 mg/kg B.S.3755可顯著提高凡納濱對蝦血清PO活力。王秀華等（2004）報道，飼料中添加肽聚糖可以提高凡納濱對蝦血清的PO活力[19]，其他研究者也報道一些免疫刺激物如β-葡聚糖、中草藥、芽孢桿菌等可提高凡納濱對蝦PO活力[13,20,27]。說明對蝦血清PO活力對免疫刺激很敏感，適合作為對蝦機體免疫狀態(tài)的評價指標。

根據(jù)本實驗的結果，飼料中添加600 mg/kg B.S.3755可提高凡納濱對蝦生長率和非特異性免疫力，降低飼料系數(shù)，并可在不影響生長性能和非特異性免疫力的情況下，以植物蛋白替代對蝦飼料中3.5%的魚粉蛋白。

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