任鵬濤，張 苑，蔡建輝，張 艷，田 青

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胃腸外科，石家莊050000）

黑色素瘤是臨床上常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)難以徹底切除，且化療、放療等常規(guī)治療方法的效果均不明顯。近年來發(fā)現(xiàn)過繼免疫治療對其有較好的療效。過繼免疫治療對腫瘤病人免疫系統(tǒng)的重建，清除微小腫瘤病灶，提高病人生活質(zhì)量及延長生存時(shí)間等具有重要的意義。但在治療過程中最關(guān)鍵的是要獲得殺傷效果好、存活時(shí)間長、數(shù)量多的免疫效應(yīng)細(xì)胞。目前常用于臨床的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer,LAK細(xì)胞）等效應(yīng)細(xì)胞都存在殺傷活性弱、增殖活性低或在臨床應(yīng)用時(shí)副作用大等問題。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer,CIK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocytes, CTL）因其具有殺瘤譜廣、增殖能力強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)從而成為現(xiàn)階段過繼免疫治療中效應(yīng)細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)試圖通過兩者對細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞凋亡的影響以及殺傷實(shí)驗(yàn)效果的研究進(jìn)一步為臨床提供更為安全、有效的腫瘤免疫治療效應(yīng)細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動物 IL-1α、IL-2、INF-γ、GM-CSF均購自美國PEPRO TECH公司，RPMI1640培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素購自美國HYCLONE公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，四甲基偶氮鹽（MTT）購自SIGMA公司。

C57BL/6小鼠（8周齡，雌性，體重15～20g，平均體重18g，共70只）由河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，按標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)環(huán)境條件飼養(yǎng)。小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹突狀細(xì)胞（DC）的制備[1]DC的培養(yǎng)：無菌條件下取小鼠脾臟（10只小鼠），研磨，200目篩網(wǎng)過濾，采用密度梯度離心，將得到的PBMC放入RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，加入24孔板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中3h。用完全培養(yǎng)液洗去非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞。加入IL-4（500U/mL）和GM-CSF（1000U/mL），于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每3d半量換液1次。

1.2.2 CIK細(xì)胞的制備[2]CIK細(xì)胞的培養(yǎng)[2]：取上述含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入INF-γ（1000U/mL），24h后加入IL-1α（100U/mL）、CD3McAb（50ng/mL）和IL-2（500U/mL），于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d半量換液1次，第14天收獲細(xì)胞。

1.2.3 腫瘤全抗原和抗原負(fù)載的DC-CIK的制備 B16黑色素瘤細(xì)胞株在PRMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代，消化收集對數(shù)生長期的該細(xì)胞，離心，洗滌，封裝入凍存管中。緩慢放入液氮內(nèi)10min，取出后立即置入37℃水浴箱中10min，該凍融步驟共重復(fù)3次。隨后將其放入離心機(jī)中3000r/min，離心10min。取上清液，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在DC培養(yǎng)的第6天加入按上述方法制備的腫瘤凍融抗原，3d后收集該DC加入CIK細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（DC∶CIK=1∶10）共同培養(yǎng)即為特異性抗原負(fù)載的DCCIK，再培養(yǎng)4d后記數(shù)并收集細(xì)胞。

1.2.4 特異性抗原負(fù)載的DC-CTL的制備[3]取正常小鼠抗凝靜脈血梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，尼龍毛柱法分離得到T淋巴細(xì)胞。將培養(yǎng)9d的DC細(xì)胞與腫瘤抗原共同孵育3d，加入培養(yǎng)5d的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，再共同培養(yǎng)24h，所獲得的細(xì)胞即為特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞。

1.2.5 建立B16黑色素瘤動物模型及效應(yīng)細(xì)胞的注射 60只C57小鼠，將低溫保存的B16惡性黑色素瘤細(xì)胞復(fù)蘇后傳代、培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，離心并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL，C57BL/6小鼠左肩背部皮膚消毒后，注射器吸取0.2mL接種于該處皮下，迅速用鑷子夾住皮膚，防止接種細(xì)胞懸液回流。然后隨機(jī)將小鼠分為3組：第1組：特異性抗原負(fù)載的DC-CIK；第2組：特異性抗原負(fù)載的DC-CTL；第3組：對照組。待小鼠注射部位形成黑色腫瘤后（接種第14天接種部位出現(xiàn)直徑0.33～1.67cm大小的腫瘤，平均直徑0.68cm），按照分組于小鼠鼠尾靜脈分別注射以上培養(yǎng)的DCCIK和DC-CTL效應(yīng)細(xì)胞，劑量均為0.2mL（細(xì)胞濃度為1×106/mL，對照組于鼠尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水）。第15天提取標(biāo)本。

1.2.6 對腫瘤細(xì)胞的體外殺傷作用的檢測 采用MTT比色法檢測2組效應(yīng)細(xì)胞對B16細(xì)胞的抑瘤作用。按效靶比例1∶10、1∶20、1∶40加入B16黑色素瘤細(xì)胞接種24h的96孔板內(nèi)，共同培養(yǎng)24h加入新鮮配制的5mg/mL的MTT 10μL，共同培養(yǎng)4h，離心（2000r/min 5min），吸棄上清液，每孔加DMSO100μL振蕩溶解10min，用酶標(biāo)檢測儀在570nm處測定吸光度A值。同時(shí)設(shè)空白對照、靶細(xì)胞對照、效應(yīng)細(xì)胞對照。每孔數(shù)值減去空白孔對照，求出3個(gè)復(fù)孔的平均A值，按下面公式計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，以殺傷率表示：殺傷率（%）=[靶細(xì)胞對照A值-（實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞對照A值）]/靶細(xì)胞對照A值×100%

1.2.7 對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響 每組取5只小鼠在治療注射結(jié)束后5d脫頸椎處死。先測量瘤體大小及瘤體重量。再取癌腫結(jié)節(jié)2份，1份用4%戊二醛固定，制備電鏡標(biāo)本，透射電鏡觀察。另1份用70%乙醇固定，制備流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)本上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算癌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）與增殖指數(shù)（PI）的比率以及細(xì)胞周期中G0/G1期、S期、G2/M期各期細(xì)胞比率，并應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差齊性t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 DC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 從外周血獲得的單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)3h后，獲得貼壁細(xì)胞，多為體積小、圓形的單個(gè)核細(xì)胞。培養(yǎng)2～3d的細(xì)胞開始出現(xiàn)變形，體積增大，由規(guī)則的圓形變?yōu)椴灰?guī)則，表面有細(xì)小的樹突狀偽足。第5天時(shí)，細(xì)胞的體積更大，表面出現(xiàn)大量毛刺狀突起，并且細(xì)胞常聚集成大小不等的細(xì)胞團(tuán)，部分細(xì)胞開始懸浮。培養(yǎng)至7～9d成熟后，大部分細(xì)胞開始懸浮，呈典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)。在掃描電子顯微鏡下可以觀察到DC細(xì)胞表面有絲狀、星型、毛棘狀等偽足樣突起（圖1）。

圖1 DC細(xì)胞電鏡圖片F(xiàn)ig 1 Morphological observation of dendritic cell(DC)

2.2 免疫表型的測定 DC高表達(dá)CD1a、CD80、CD86、HLA-DR；流式細(xì)胞檢測表明CIK細(xì)胞屬于異質(zhì)細(xì)胞群，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，CD3+CD8+、CD3+CD56+所占細(xì)胞的比率明顯升高。

2.3 DC-CIK和DC-CTL的抑瘤作用 DC-CIK組腫瘤平均體積（0.0377±0.0128）cm3，DC-CTL組腫瘤平均體積（0.0359±0.0131）cm3，對照組腫瘤平均體積（0.4052±0.0429）cm3。DC-CIK組和DC-CTL組腫瘤體積明顯小于對照組（P<0.05），DC-CIK組和DC-CIK組兩組之間比較，雖然DC-CTL組體積略小，但沒有顯著性差異（P>0.05）。瘤體重量對照組為（2.061±1.07）g，DC-CIK組（0.958±0.32）g，DCCTL組（0.939±0.41）g，兩實(shí)驗(yàn)組瘤體重量明顯小于對照組（P<0.05），但兩實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.4 對腫瘤細(xì)胞凋亡作用的影響

2.4.1 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況 透射電鏡觀察對照組小鼠瘤細(xì)胞核增大、畸形，核膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)少，核質(zhì)比例失調(diào)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量線粒體、游離核蛋白體豐富；實(shí)驗(yàn)組可見瘤細(xì)胞體積不同程度的減小，形態(tài)不規(guī)則，與鄰近的瘤細(xì)胞脫離，且細(xì)胞核皺縮，胞質(zhì)濃縮，線粒體空泡化，核異染色質(zhì)邊集，濃縮成半月形，可見小而圓的無結(jié)構(gòu)的凋亡小體。部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜破壞，胞質(zhì)外溢。

2.4.2 DC-CIK細(xì)胞、DC-CTL細(xì)胞對癌細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)組兩組細(xì)胞，流式細(xì)胞DNA直方圖上均可見不同程度的凋亡峰，而對照組未見凋亡峰（圖2）。

圖2 凋亡峰在實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)Fig 2 Apoptosis peak observed in experiment group

實(shí)驗(yàn)組兩組細(xì)胞作用后與對照組細(xì)胞相比較，瘤細(xì)胞中G0/G1期比率和細(xì)胞AI顯著增加（P<0.05），S期未見顯著變化（P>0.05），G2/M期細(xì)胞比率和細(xì)胞PI下降（P<0.05），但實(shí)驗(yàn)組兩組之間沒有有顯著差異（P>0.05），見表1。

2.5 細(xì)胞體外抑瘤作用 DC-CIK和DC-CTL對腫瘤細(xì)胞都有較強(qiáng)的殺傷作用，但DC-CTL對B16黑色素細(xì)胞的殺傷作用明顯高于DC-CIK（P<0.05），且殺傷活性隨著效靶比的增加而升高，見表2。

表1 DC-CIK、DC-CTL細(xì)胞對B16黑色素瘤細(xì)胞G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比率及對AI、PI的影響Tab 1 Effect of DC-CIK cells and DC-CTL cells on the rate of B16melanoma cells in G0/G1,S,G2/M stages,PI and AI rate of tumor cells

表2 DC-CIK和DC-CTL對B16黑色素瘤的殺傷活性Tab 2 Killing activity of DC-CIK and DC-CTL effector cells to B16melanoma cells

3 討論

樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)最重要的、功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它能有效的攝取、加工、遞呈腫瘤抗原，在機(jī)體的抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用[4]。CIK細(xì)胞是在體外通過加入不同的細(xì)胞因子刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)而獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)[5]。眾多研究表明DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)可以提高CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒殺傷作用[6-8]，其機(jī)制可能為（1）DC細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，如IL-2、INF-γ等可以促進(jìn)CIK細(xì)胞的進(jìn)一步成熟。（2）DC分泌的IL-12明顯升高，誘導(dǎo)Th-1型免疫應(yīng)答，可以進(jìn)一步清除腫瘤細(xì)胞。且腫瘤細(xì)胞總蛋白中包含有豐富的膜抗原、MHC抗原表位等成分，經(jīng)過特異性抗原致敏的DC細(xì)胞的攝取、加工和遞呈后，可誘導(dǎo)針對該特異性抗原的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)。腫瘤特異性CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷在腫瘤免疫應(yīng)答中起著極為重要的作用[9]。由于腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原肽水平較低，不易于被T淋巴細(xì)胞所識別，難以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。而CTL細(xì)胞的激活需要腫瘤抗原致敏和抗原遞呈細(xì)胞所提供的共刺激因子，DC作為功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，可以提供共刺激因子來誘導(dǎo)CTL的腫瘤殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)特異性抗原致敏的DC-CIK和DC-CTL對腫瘤細(xì)胞都有較強(qiáng)的殺傷作用，說明DC已經(jīng)成功攝取了B16黑色素瘤細(xì)胞抗原遞呈給淋巴細(xì)胞激活了針對B16黑色素瘤的特異性殺傷作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明DC-CTL的殺傷作用明顯高于DC-CIK，說明雖然特異性抗原致敏的DC-CIK有一定的殺傷能力，但可能由于腫瘤細(xì)胞的免疫逃避等因素使得總的殺傷效能較DC-CTL低，但其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡也是治療腫瘤的有效方法。此次實(shí)驗(yàn)表明，特異性抗原致敏的DC-CIK和DC-CTL對腫瘤細(xì)胞都有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，兩者之間并沒有明顯的差異。一些研究表明CIK和CTL都通過Fas/FasL系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但具體的途徑尚不明了[10-11]。

本研究表明特異性抗原致敏的DC-CIK與DC-CTL細(xì)胞可以有效的殺傷B16黑色素瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，但DC-CTL的殺傷效能較DCCIK明顯增高，雖然其機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但仍然為臨床提供更為安全、有效的腫瘤免疫治療效應(yīng)細(xì)胞提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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