李 靜，孫保存，古 強，董學易，韓春榮，宗文康，趙 楠，劉艷榮，趙秀蘭

（1.天津醫(yī)科大學病理學教研室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科，天津300060）

惡性黑色素瘤是起源于神經(jīng)嵴黑色素細胞的惡性腫瘤，其主要病變特點是發(fā)病年齡早、轉(zhuǎn)移率高、血液供應豐富，具有多種血管生成模式[1]。目前在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的微循環(huán)模式有內(nèi)皮依賴性血管、馬賽克血管和血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM），VM參與構(gòu)筑腫瘤組織的功能性微循環(huán)，與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為有關(guān)。線形程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）是黑色素瘤組織中存在的一種特殊形式的程序性死亡現(xiàn)象，本課題組前期研究工作表明LPPCN可能為VM、內(nèi)皮依賴性血管形成提供一定的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對血管生長具有強誘導作用，是作用于血管內(nèi)皮細胞的重要生長因子之一，并直接參與誘導腫瘤血管生成。因此，本實驗對VEGF及其受體（Flt-1、Flk-1）是否參與LPPCN到VM的轉(zhuǎn)變及其在病人預后中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院1996年7月～2007年11月間經(jīng)手術(shù)切除、福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋并經(jīng)兩位病理醫(yī)師診斷證實為黑色素瘤的石蠟標本，共70例。所有病例均診斷明確，臨床資料及隨訪資料完整。

1.2 實驗方法 石蠟標本常規(guī)切片，分別作HE染色、CD31與PAS雙重染色以及免疫組織化學二步法進行VEGF、Flt-1、Flk-1染色。兔抗人CD31多克隆抗體（Ab28464）稀釋度1∶50，購自Abcam公司，兔抗人VEGF多克隆抗體稀釋度1∶100，購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，兔抗人Flt-1多克隆抗體(RB-1527-P0)稀釋度1∶100，購自Thermo公司，鼠抗人Flk-1單克隆抗體（sc-6251）稀釋度1∶100，購自SANTA CRUZ公司。用已知陽性片和PBS代替一抗分別作陽性和陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 VEGF免疫組化染色以細胞漿內(nèi)和(或)細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。Flt-1和Flk-1表達定位于細胞漿內(nèi)和腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。分別選取典型的5個LPPCN及VM區(qū)域，在400倍光鏡下分別計數(shù)LPPCN及VM周圍腫瘤細胞1～3層、4～6層及7～9層中的陽性率，取平均值。根據(jù)腫瘤細胞陽性率結(jié)合染色強度綜合評價染色指數(shù)。染色強度：腫瘤細胞無著色為0，染成淺黃色為1，棕黃色為2，深黃色為3；陽性率的評定：0～19%陽性細胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為0，20%～39%陽性細胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為1，40% ～59%陽性細胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為2，>60%陽性細胞轉(zhuǎn)換數(shù)值為3。染色指數(shù)為染色強度和染色陽性細胞率轉(zhuǎn)換數(shù)值的總和，染色指數(shù)<1為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0for windows統(tǒng)計軟件包和Excel 2003進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用ANOVA分析。采用Kaplan-Meier估計生存曲線法做出各組間的生存曲線，對數(shù)秩和檢驗(Log-rank test)法比較各組間的生存曲線的差別。計數(shù)資料采用四格表的確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE、CD31與PAS染色結(jié)果 顯微鏡下，HE染色的LPPCN細胞的胞核深染、細胞漿濃縮、細胞之間界限清楚。LPPCN呈線形、網(wǎng)狀、分支狀排列，穿插于周圍腫瘤組織之間（圖1）。隨機選取10個高倍視野（×200），分別計數(shù)100個腫瘤細胞，LPPCN的平均細胞數(shù)少于5%者記為陰性，70例黑色素瘤組織標本中，LPPCN陽性者占54.29%（38/70）。CD31/ PAS雙染切片出現(xiàn)CD31染色陰性，而由PAS陽性物質(zhì)圍成的管腔結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)存在紅細胞，周圍沒有出血壞死和炎癥細胞浸潤，此為VM陽性（圖2）。70例標本中VM陽性率為47.14%（33/70）。

圖1 HE染色(×200)Fig 1 HE staining(×200)

圖2 CD31/PAS雙重染色(×400)Fig2CD31/PASdoublestaining（×400）

2.2 VEGF、Flt-1及Flk-1在LPPCN和VM周圍腫瘤細胞中的表達 VEGF在LPPCN周圍腫瘤細胞1～3層中的表達強于其外圍腫瘤細胞（P<0.01），在外圍4～6層與7～9層之間的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖3）。Flk-1在LPPCN周圍腫瘤細胞1～3層中的表達強于其外圍腫瘤細胞（P<0.01），在外圍4～6層與7～9層之間的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖4）。而Flt-1在LPPCN周圍腫瘤細胞1～3層、4～6層及7～9層之間的表達差異均無統(tǒng)計學意義（圖5），VEGF、Flt-1、Flk-1在VM周圍的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖6～8），見表1。

圖3 VEGF免疫組化染色(×200)Fig 3 Immunohistochemical

圖4 Flk-1免疫組化染色(×200)Fig 4 Immunohistochemical staining of Flk-1(×200)

2.3 LPPCN周邊VEGF(+)組與VEGF（-）組的生存分析 在LPPCN周邊，VEGF（+）組共27例，VEGF（-）組共11例（圖9），LPPCN周邊VEGF（+）組的生存時間比LPPCN周邊VEGF（-）組短，其生存曲線的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.083，P=0.037）。生存曲線圖見圖10。

圖5 Flt-1免疫組化染色(×200)Fig 5 Immunohistochemical staining of Flt-1(×200)

圖6 VEGF免疫組化染色(×400)Fig 6 Immunohistochemical stainingofVEGF(×400)

圖7 Flt-1免疫組化染色(×400)Fig 7 Immunohistochemical staining of Flt-1(x400)

圖8 Flk-1免疫組化染色(×400)Fig 8 Immunohistochemical staining of Flk-1(×400)

圖9 VEGF免疫組化染色(×200)Fig 9 Immunohistochemical staining of VEGF(×200)

圖10 生存曲線圖Fig 10 Kaplan-Meier survive curves plot

2.4 LPPCN周邊VEGF(+)組與VEGF（-）組中VM的情況 在27例LPPCN周邊VEGF(+)組中，VM（+）組有23例，在11例LPPCN周邊VEGF(-)組中，VM（+）組有5例，LPPCN周邊VEGF(+)組中VM的陽性率高于LPPCN周邊VEGF(-)組中VM的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049），見表2。

表1 VEGF、Flt-1、Flk-1在黑色素瘤LPPCN及VM周圍的表達（±s）Tab 1 Expression of VEGF,Flt-1and Flk-1surrounding LPPCN and VM in melanoma（±s）

表1 VEGF、Flt-1、Flk-1在黑色素瘤LPPCN及VM周圍的表達（±s）Tab 1 Expression of VEGF,Flt-1and Flk-1surrounding LPPCN and VM in melanoma（±s）

A1組:LPPCN周邊第1～3層腫瘤細胞染色指數(shù)；B1組:LPPCN周邊第4～6層腫瘤細胞染色指數(shù)；C1組:LPPCN周邊第7～9層腫瘤細胞染色指數(shù)；A2組:VM周邊第1～3層腫瘤細胞染色指數(shù)；B2組:VM周邊第4～6層腫瘤細胞染色指數(shù)；C2組: VM周邊第7～9層腫瘤細胞染色指數(shù)；*P<0.05

組別A1組B1組C1組A2組B2組C2組q A1:B1A1:C1B1:C1A2:B2A2:C2B2:C2n 383838333333VEGF 2.52±1.331.55±0.971.48±1.152.86±1.112.90±0.972.55±0.99Flt-13.45±0.622.19±0.401.71±0.462.80±0.953.15±0.813.00±0.80Flk-13.46±0.722.17±0.381.62±0.583.32±0.783.45±0.743.36±0.660.986* 1.046* 0.0610.0520.3140.3510.1920.4830.2910.3080.1580.1510.725* 0.683* 0.0420.1690.0780.091

表2 LPPCN周邊VEGF表達與VM陽性率(%)的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of VEGF surrounding LPPCN and the VM positive rate（%）

3 討論

1999年，Maniotis等[3]在研究高度惡性黑色素瘤時揭示了一種新的血管生成方式，即VM。VM是惡性黑色素瘤細胞通過自身變形和與細胞外基質(zhì)相互作用，模擬血管壁結(jié)構(gòu)形成的可輸送血液的管道系統(tǒng)。其特點是血管壁的內(nèi)側(cè)全部由腫瘤細胞襯覆，而非內(nèi)皮細胞，并且此通道中存在紅細胞。研究表明，有多種細胞因子影響和參與了其形成過程。如同血管生成過程中，血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖，在腫瘤組織中出芽，最終形成管道網(wǎng)絡[4]的過程一樣，VM形成中也存在管道的空間構(gòu)筑過程。那么，實體瘤組織中，細胞排列緊密，間質(zhì)液體壓力極高，腫瘤細胞是如何獲得形成VM所需的空間呢？LPPCN現(xiàn)象也許能夠在一定程度上解釋這個謎團。

LPPCN是黑色素瘤組織中存在的一種特殊形式的程序性死亡現(xiàn)象，在HE染色切片中可觀察到大片實體的腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)條帶樣（線形分布）的一群胞核深染、胞漿濃縮且細胞間彼此分離的腫瘤細胞，此即是LPPCN。本課題組前期實驗在人體黑色素瘤和小鼠黑色素瘤移植瘤中均觀察到當腫瘤的血管生長無法滿足腫瘤的快速生長時，在腫瘤的中央部缺少血管的區(qū)域，由于嚴重缺氧并在高壓環(huán)境下腫瘤細胞便可能啟動一系列機制形成LPPCN[5]。隨后這些條帶結(jié)構(gòu)內(nèi)的腫瘤細胞發(fā)生核碎裂、溶解，細胞解體，在腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)了一些分布呈網(wǎng)絡狀的線形空間結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)與內(nèi)皮依賴性血管相通的現(xiàn)象，有時在一個內(nèi)皮依賴性血管的周圍可見數(shù)個呈網(wǎng)絡狀分布的線形結(jié)構(gòu)。LPPCN和VM的空間分布呈網(wǎng)絡狀，類似于內(nèi)皮依賴性血管的空間分布。因此，推測這些發(fā)生LPPCN的腫瘤細胞死亡后殘留的空間可以作為VM形成的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而LPPCN周邊的腫瘤細胞與VM形成之間有什么關(guān)系呢？針對這一問題，本實驗研究了LPPCN周邊腫瘤細胞VEGF及其受體的表達和VM形成的關(guān)系。

眾所周知，缺氧是實體瘤物理微環(huán)境的基本特征之一。惡性黑色素瘤進展區(qū)域乏氧，導致轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達增高，而HIF-1α刺激腫瘤細胞和宿主細胞合成分泌多種促血管生成因子，尤其是具有重要作用的VEGF。HIF-1α的功能不僅使其下游因子VEGF的mRNA穩(wěn)定性增加，而且能增加VEGF的轉(zhuǎn)錄活性[6]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在LPPCN周邊的腫瘤細胞高表達VEGF，明顯強于遠離LPPCN的腫瘤細胞，這可能是由于在LPPCN周邊的腫瘤細胞處于相對較嚴重的缺氧狀態(tài)，而遠離LPPCN的腫瘤細胞缺氧較輕，這種由重到輕的缺氧梯度導致了VEGF表達的高低不同。而且已有研究表明，只有VEGF表達高的細胞才有形成VM的潛能[7]。同時，本實驗對于VEGFR2（Flk-1）的研究結(jié)果顯示，在LPPCN周邊的腫瘤細胞Flk-1的表達強于遠離LPPCN的腫瘤細胞，這可能是VEGF發(fā)揮刺激內(nèi)皮細胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通過結(jié)合和激活Flk-1來實現(xiàn)的?？梢姷脱醪粌H可以促進腫瘤細胞VEGF的高表達，而且可以通過誘導VEGF受體表達上調(diào)來調(diào)節(jié)VEGF的功能。而對于VEGFR1（Flt-1），其與VEGF結(jié)合后所起的生理作用尚不明確，F(xiàn)lt-1可能是作為VEGF促血管生成的反向調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用[8]。在本實驗中也觀察到Flt-1在LPPCN周圍的表達無差異。

相對于LPPCN周圍腫瘤細胞VEGF、Flt-1及Flk-1的表達情況，在VM周圍三者的表達沒有差異,這可能是因為VM有助于腫瘤細胞獲得足量的血液供應，氧氣充足，刺激腫瘤細胞表達VEGF及其受體的主要誘因缺氧減弱，因此腫瘤細胞表達VEGF降低。Sun等[9]的研究也表明，沒有缺氧的刺激，腫瘤細胞會下調(diào)對VEGF的表達。本實驗結(jié)果提示，LPPCN與VM周圍腫瘤細胞的促血管生成因子的表達差異或許可以間接地說明VEGF主要在VM形成的早期起作用，當VM形成后，有充足的血液供應使缺氧減輕就會使VEGF的表達下調(diào)。

進一步研究還發(fā)現(xiàn)，LPPCN周邊VEGF陽性組的VM陽性率高于LPPCN周邊VEGF陰性組的VM陽性率，且LPPCN周邊VEGF陽性組患者生存時間比LPPCN周邊VEGF陰性組患者短。推測在LPPCN殘留的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，其周邊高表達VEGF的腫瘤細胞有更多機會形成VM。由于VM無血管內(nèi)皮細胞襯覆，腫瘤細胞直接與血液接觸，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為造成患者不良預后的一個影響因素。

綜上所述，在黑色素瘤組織中VM形成早期，VEGF及其受體Flk-1可能起一定的作用，且其高表達是患者不良臨床預后的一個影響因素，但不一定是獨立的關(guān)鍵影響因素。VM可能是由LPPCN周邊的腫瘤細胞通過一定的機制轉(zhuǎn)變而形成的。但是，VEGF及其受體具體是通過何種途徑影響VM的形成？它們與其他細胞因子在形成VM過程中的相互作用關(guān)系如何？通過抑制VEGF的表達是否能減少VM的形成，進而達到治療黑色素瘤的目的？這些問題需要進一步研究VEGF及其受體在VM形成過程中發(fā)揮的具體作用及其詳盡機制來解決。

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