張 婧，周洪經(jīng)，李曉眠

（天津醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，天津 300070）

輪狀病毒(rotavirus,RV)屬呼腸孤病毒科，是嬰幼兒急性感染性腹瀉的主要病原體，占嬰幼兒腹瀉的50%[1]。目前無有效的西藥治療[2]。胃腸安丸為純中藥制劑，處方由木香、沉香、厚樸等11味藥組成。現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明其有明顯的抗腹瀉作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌及痢疾志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、鮑氏志賀菌等8株菌種均有明顯的殺菌作用，還對(duì)致病病毒的基因有一定影響，可達(dá)到降解病毒核酸的目的，與西藥相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)[3]。本研究旨在探討胃腸安丸在體外對(duì)RV的治療作用，為篩選新型抗輪狀病毒的中成藥提供實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株與細(xì)胞株 猴輪狀病毒SA11株，非洲恒源猴腎細(xì)胞（MA104細(xì)胞）（天津醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供）。

1.1.2 藥物 胃腸安丸由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10880010。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性健康Wistar大鼠,體重均約250g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（津）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2005-001。

1.1.4 試劑和儀器 DMEM-HG培養(yǎng)基 (Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Hyclone)，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（BIOFIL公司）, CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma，3111型），倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss，Axiorert 200），酶標(biāo)儀（Multiskan Mk3,Thermo Labsystems公司），高速離心機(jī)（Beckman coulter）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MA104細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)傳代。

積極的激勵(lì)性外部環(huán)境能促進(jìn)提升一般創(chuàng)造力。組織營(yíng)造積極的激勵(lì)性外部環(huán)境條件，如塑造組織整體的創(chuàng)新氛圍、明確闡明整體任務(wù)目標(biāo)、給予經(jīng)常性的關(guān)于如何改進(jìn)工作的反饋、提供強(qiáng)有力的團(tuán)隊(duì)支持、實(shí)施鼓勵(lì)性監(jiān)督、創(chuàng)造信任的工作關(guān)系、較多的知識(shí)共享空間、給予足夠的資源，等等，都可以形成良好的外部環(huán)境，提升個(gè)體一般創(chuàng)造力。與此同時(shí)，減少消極的外部環(huán)境，如過多的工作量和緊急期限、競(jìng)爭(zhēng)性績(jī)效、可預(yù)見的負(fù)面評(píng)價(jià)、教條的組織結(jié)構(gòu)，以及開展工作的種種限制等，則可以大大減小消極性外部環(huán)境因素對(duì)一般創(chuàng)造力的影響。

1.2.2 病毒的傳代及毒力測(cè)定 SA11株解凍，乙酰胰酶37℃處理病毒懸液1h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）將細(xì)胞瓶中MA104細(xì)胞單層洗3遍，加入胰酶處理過的SA11株1mL，37℃，5%CO2孵箱中吸附1.5h，加入10mL含5μg/mL胰酶的DMEM-HG培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)病變達(dá)“+++”后，凍融2次，4000r/min離心10min，取上清，-70℃保存。SA11株在MA104細(xì)胞上多次傳代提高病毒毒力，待毒力穩(wěn)定后用于實(shí)驗(yàn)。按病毒致細(xì)胞病變作用（CPE）終點(diǎn)稀釋法，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上滴定半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50）為10-6.3[4]。本實(shí)驗(yàn)用100TCID50/0.1mL。

1.2.3 SA11株電鏡觀察

1.2.3.1 病毒的提純：取經(jīng)凍溶3次的SA11株80mL，8000r/min，30min，取上清70mL，27000r/min，2h，棄上清，用1mL DMEM-HG培養(yǎng)基懸浮沉淀。

1.2.3.2 透射電鏡標(biāo)本的制備和電鏡觀察：經(jīng)高速離心的病毒懸浮液滴在具有Formvar支持膜的300目銅網(wǎng)上，1～2min后用濾紙靠近銅網(wǎng)邊緣，吸去銅網(wǎng)上的液體，用pH7.4的20g/L的磷鎢酸負(fù)染1min，用濾紙吸走多余染液，干燥后在透射電鏡（電鏡型號(hào)：Philips EM400ST）下進(jìn)行觀察，每份標(biāo)本觀察1～2個(gè)銅網(wǎng)，并照相[5]。

1.2.4 SA11株dsRNA的檢查 按Z.E.N.A病毒RNA試劑盒說明書操作。提取的SA11株dsRNA用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）4h，凝膠用硝酸銀染色檢查dsRNA圖型。

1.2.5 藥物的配制 取胃腸安丸藥物1g乳缽中研碎，放刻度離心管中加水至10mL，水浴煮沸20min，離心2000r/min，10min，取上清，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.6藥物毒性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度每毫升為105的MA104細(xì)胞懸液100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)24h，在單層細(xì)胞上分別加入不同濃度的藥物（10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01mg/mL），每孔100μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)72h，每日觀察細(xì)胞變化，記錄CPE、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算藥物的最大無毒濃度（TC0）和半數(shù)毒性濃度（TC50）。

1.2.7 細(xì)胞水平上胃腸安丸對(duì)SA11株的作用

1.2.7.1 藥物對(duì)病毒感染的預(yù)防作用：用不同濃度藥物預(yù)先處理96孔細(xì)胞板中的單層MA104細(xì)胞1.5h，PBS洗滌后加入經(jīng)胰酶處理過的100TCID50/ 0.1mL的SA11株100μL/孔。吸附1.5h后棄去，加100μL/孔的DMEM-HG培養(yǎng)基維持，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)，每日觀察，72h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算抑制率[4]。

1.2.7.3 藥物對(duì)病毒感染的直接滅活作用：將不同濃度的藥物與經(jīng)胰酶處理過的100TCID50/0.1mL的SA11株各100μL，混合作用1.5h后接種在用PBS洗滌過的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞上，吸附1.5h后棄去，加100μL/孔的DMEM-HG培養(yǎng)基維持，同上法培養(yǎng)與檢測(cè)。

1.2.7.4 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 血清水平上胃腸安丸對(duì)SA11株的作用

1.2.8.1 含藥血清的制備：取濃度為2.4mg/mL的胃腸安丸1mL（相當(dāng)于成人臨床推薦劑量的6倍）給大鼠灌胃，給藥前禁食禁水12h，灌胃前第1次內(nèi)眥采血。灌胃后25min第2次采血，以后每隔20min采血1次，每次取血約1.5mL，共6次。分離血清，56℃，30min滅活后用0.22μm的濾器除菌，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清樣本分別用DMEM-HG培養(yǎng)基稀釋1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，-20℃保存。

1.2.8.2 最適血清濃度測(cè)定：不同濃度的大鼠含藥血清按100μL/孔接種在用PBS洗滌過的單層MA104細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，同時(shí)用100TCID50/0.1mL的SA11株感染細(xì)胞，另設(shè)等梯度濃度的正常血清組，病毒對(duì)照組，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)72h，每日觀察細(xì)胞變化，記錄CPE。

1.2.8.3 含藥血清對(duì)SA11株的抑制作用：將不同時(shí)間點(diǎn)采集的大鼠含藥血清分別用DMEM-HG培養(yǎng)基稀釋至最適血清濃度，按100μL/孔接種在用PBS洗滌過的單層MA104細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，同時(shí)用100TCID50/0.1mL的SA11株感染細(xì)胞，另設(shè)正常血清組，病毒對(duì)照組，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)72h，每日觀察細(xì)胞變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算抑制率。

1.2.9 分析方法 MA104細(xì)胞病變程度判定標(biāo)準(zhǔn)（CPE記錄方法）：“+”為細(xì)胞病變25%以下；“++”為細(xì)胞病變25%～50%；“+++”為細(xì)胞病變50%～75%；“++++”為細(xì)胞病變75%以上。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570值-空白對(duì)照組A570值）/（正常細(xì)胞對(duì)照組A570值-空白對(duì)照組A570值）×100%；病毒抑制率（%）=（藥物處理組A570值-病毒對(duì)照組A570值）/（細(xì)胞對(duì)照組A570值-病毒對(duì)照組A570值）×100%。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的TC50和藥物對(duì)

病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50），治療指數(shù)（TI）=TC50/IC50。運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均以±s表示。多組數(shù)據(jù)間的比較用one-wayANOVA進(jìn)行比較；抑制率(或細(xì)胞存活率)與藥物濃度間的關(guān)系用Probit回歸分析。采用TI作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來衡量藥物對(duì)病毒抑制的效力。指數(shù)大于1為有效，指數(shù)越大，安全范圍越大[6]。

2 結(jié)果

2.1 SA11株電鏡觀察結(jié)果 電子顯微鏡下，絕大部分SA11株呈實(shí)心顆粒，形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，呈車輪狀 (具有輻條狀結(jié)構(gòu)及一個(gè)非常清晰平滑的周邊)。少部分病毒出現(xiàn)空心顆粒（圖1）。

圖1 輪狀病毒SA11株經(jīng)高速離心提純后電鏡觀察結(jié)果Fig 1 Results of electron microscopy of Rotavirus SA11strain purified by high speed centrifugation

2.2 輪狀病毒核酸（dsRNA） 用PAGE檢查dsRNA有清晰的典型的A群輪狀病毒SA11株病毒核酸電泳圖型（4：2：3：2）（圖2）。

圖2 SA11株病毒核酸PAGE電泳圖型Fig 2 Virus nucleic acid PAGE electrophoresis of SA11strain

2.3 藥物毒性 不同濃度胃腸安丸接種于細(xì)胞72h，0.625mg/mL及其以下濃度未見出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性改變，即胃腸安丸的TC0為0.625mg/mL。TC50為1.25mg/mL。測(cè)定的MTT值進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。

2.4 細(xì)胞水平上胃腸安丸對(duì)SA11株的作用 在預(yù)防、治療和直接滅活作用中胃腸安丸濃度為0.625mg/mL時(shí)能明顯抑制病毒增殖，濃度為0.313mg/mL、0.16mg/mL、0.08mg/mL時(shí)效果次之。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在預(yù)防、治療和直接滅活作用中胃腸安丸為上述濃度時(shí)與病毒對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鏡下觀察的結(jié)果跟統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致，說明胃腸安丸有抑制SA11感染細(xì)胞的作用，且胃腸安濃度為0.625mg/mL時(shí)效果最好。見表1。

表1 胃腸安丸抗輪狀病毒作用 （±s）Tab 1 The anti-rotavirus activity of Weichang’an pill（±s）

表1 胃腸安丸抗輪狀病毒作用 （±s）Tab 1 The anti-rotavirus activity of Weichang’an pill（±s）

與病毒對(duì)照組比較*P＜0.05

胃腸安丸濃度(mg/mL）0.010.020.040.080.160.3130.625病毒對(duì)照組正常細(xì)胞對(duì)照組IC50(mg/mL) TI預(yù)防作用 治療作用 直接滅活作用A值A(chǔ)值A(chǔ)值0.453±0.0180.460±0.0420.477±0.0550.563±0.003* 0.663±0.002* 0.783±0.003* 0.806±0.003* 0.450±0.0030.981±0.004抑制率（%）0.611.915.2021.2140.1262.7767.05抑制率（%）1.792.905.0921.3140.0362.6867.02抑制率（%）3.9228.1046.6157.4060.2163.9771.24－－0.460±0.0460.466±0.0580.478±0.0480.564±0.003* 0.663±0.002* 0.783±0.003* 0.806±0.003* 0.451±0.0030.981±0.004－－0.451±0.0650.585±0.065* 0.687±0.002* 0.746±0.004* 0.761±0.004* 0.782±0.003* 0.823±0.002* 0.430±0.0050.981±0.004－－－－0.2614.79－－0.2694.67－－0.11410.96

2.5 血清水平上胃腸安丸對(duì)SA11株的作用

2.5.1 最適血清濃度測(cè)定 鏡下結(jié)果表明同一時(shí)間不同濃度大鼠含藥血清的作用效果類似，正常血清在稀釋度為1∶8以上時(shí)對(duì)細(xì)胞的毒性作用減輕。含胃腸安丸的血清稀釋度在1∶2、1∶4時(shí)，表現(xiàn)同正常血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用。1∶16含藥血清與病毒對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)有明顯差別，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，且此時(shí)血清的毒性作用小。

2.5.2 含藥血清對(duì)SA11株的抑制作用 含藥血清45min組和65min組時(shí)細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)于病毒對(duì)照組和含藥血清的其它各組，抑制SA11株增殖顯著,細(xì)胞存活良好。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示含藥血清各組均與病毒對(duì)照組、正常血清組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見 表2。

表2 不同時(shí)間含藥血清對(duì)病毒的抑制率（%）Tab 2 The viral inhibition of the concentration of drug in serum at different times（%）

用MTT法測(cè)得含胃腸安丸血清對(duì)輪狀病毒的抑制率，繪制時(shí)間—效應(yīng)曲線（圖3），表明含藥血清對(duì)輪狀病毒的抑制作用與藥物在體內(nèi)的代謝時(shí)間有關(guān)。在給藥后45～65min之間，藥物在血清中濃度最高。

圖3 胃腸安丸含藥血清時(shí)間—效應(yīng)曲線Fig 3 The time-effect curve of concentration of Weichang’an pill in serum

3 討論

RV是引起急性感染性腹瀉的主要病原體。據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，每年全世界感染輪狀病毒者有2億人，因RV感染而死亡的超過100萬人[7]。它是嬰幼兒急診和死亡的第二大疾病，嚴(yán)重威脅人類健康,是世界衛(wèi)生組織和我國(guó)重點(diǎn)防治的疾病之一。由RV引起的腹瀉占我國(guó)腹瀉病的50%。目前，對(duì)RV治療藥物,主要是對(duì)癥治療。中藥對(duì)腹瀉的治療有一定的優(yōu)勢(shì)。胃腸安丸具有芳香化濁，理氣止痛，健胃導(dǎo)滯的功能，用于消化不良引起的腹瀉、腸炎、菌痢、脘腹脹滿、腹痛、食積乳積。臨床用胃腸安丸治療RV感染性腹瀉，療效顯著[8-9]。本實(shí)驗(yàn)研究了胃腸安丸及血清體外抗RV的作用，結(jié)果顯示：胃腸安丸血清可增強(qiáng)MA104細(xì)胞的抗RV感染的作用，對(duì)RV感染的MA104細(xì)胞有顯著的預(yù)防、治療和直接滅活作用，可降低RV的毒力，削弱其感染能力。

RV屬呼腸孤病毒科，根據(jù)內(nèi)層殼衣中VP6蛋白上抗原的差異，被分為A、B、C、D、E、F、G 7組，RV有很強(qiáng)的宿主局限性[10]。感染人類的主要為A、B組，病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合是病毒感染的關(guān)鍵，阻斷病毒對(duì)靶細(xì)胞的吸附可減弱病毒的毒力。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃腸安丸血清能提高細(xì)胞抗SA11株病毒感染的能力，降低病毒的毒力，可能是減弱病毒對(duì)靶細(xì)胞的吸附，降低細(xì)胞與病毒親和力的雙重作用。鑒于國(guó)內(nèi)外對(duì)胃腸安丸研究甚少，所以對(duì)感染后的細(xì)胞抗RV的機(jī)制還知之甚少，尚待進(jìn)一步研究。本結(jié)果表明，胃腸安丸可提高細(xì)胞對(duì)RV的耐受，降低病毒的毒力。由此可推測(cè)胃腸安丸可減輕RV對(duì)靶細(xì)胞的感染。為臨床胃腸安丸治療腹瀉提供了理論基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用依據(jù)。

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