孔凡銘，張新偉，于津浦，魏 楓，李 慧，任秀寶

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院免疫室，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060）

p53凋亡刺激蛋白家族的抑制成員(inhibitory member of the ASPP family,iASPP)是最近發(fā)現(xiàn)的能特異性抑制p53抑癌功能的蛋白[1]，并在多種腫瘤細(xì)胞中存在過表達(dá)現(xiàn)象，且能抑制p53的促凋亡活性[1-6]，提示抑制iASPP的高表達(dá)可能成為恢復(fù)p53抑癌功能的新策略。本研究成功構(gòu)建FLAG-pcDNA3.0-iASPP質(zhì)粒，并初步驗(yàn)證該質(zhì)粒能夠正確編碼FLAG-iASPP蛋白，促進(jìn)NIH 3T3細(xì)胞增殖。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒及試劑 FLAG-pcDNA3.0載體系中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血研所王建祥教授惠贈(zèng)；PCMV-iASPP克隆購自O(shè)riGene公司；大腸桿菌DH5α和NIH3T3細(xì)胞系由本室保存；引物合成、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑均為Invitrogen公司提供；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；小鼠iASPP單克隆抗體購自Sigma公司，山羊抗小鼠（HRP標(biāo)記）抗體購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自HyClone公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自TIANGEN公司；PCR試劑購自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 FLAG-pcDNA3.0-iASPP質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank iASPP基因序列信息，設(shè)計(jì)并合成引物。引物正義鏈：5′-AGCTGAATTCCGCCACCATGGACAGCGAGGCATTC-3′，5′端加入EcoR I酶切位點(diǎn)；反義鏈：5′-TAGTCTCGAGCTAGACTTTACTCCTTTGAGGCTTCACC C-3′，5′端加入Xho I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物約2713bp。以源克隆PCMV-iASPP為模板PCR擴(kuò)增iASPP的CDS區(qū)，Eco R I與Xho I限制性內(nèi)切酶消化真核表達(dá)載體FLAG-pcDNA3.0及切膠回收的PCR產(chǎn)物。再次純化后，T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)12h。挑取單個(gè)克隆進(jìn)行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。其中測(cè)序工作委托上海Invitrogen公司完成。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選 NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，收獲細(xì)胞。以5×104/孔接種于6孔板中，孵育24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按Lipofectin Reagent試劑盒操作說明，將FLAG-pcDNA3.0-i ASPP和空載體FLAG-pcDNA3.0各4μg，分別轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后更換完全培養(yǎng)基，48h后1∶10傳代并以500μg/mL G418篩選21～30d，所得陽性克隆繼續(xù)培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞作空白對(duì)照。

1.2.3 FLAG-pcDNA3.0-iASPP在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)

1.2.3.1 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)：將篩選出的G418抗性克?。ㄞD(zhuǎn)染空載體FLAG-pcDNA3.0、轉(zhuǎn)染FLAG-pcDNA 3.0-iASPP的NIH3T3細(xì)胞）及未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用TRIzol試劑提取總RNA，設(shè)計(jì)上下游引物并行RT-PCR擴(kuò)增鑒定。上游引物：5′-GTGAA GGAGATGAACGACCCG-3′，下游引物：5′-GGCGCAGTCAGCATAACCC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為297bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共27個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3.2 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：細(xì)胞裂解液裂解上述對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加4×SDS上樣緩沖液，煮沸5min。各樣品取等量，進(jìn)行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，按Western b1otting常規(guī)操作依次進(jìn)行封閉、與抗iASPP單克隆抗體反應(yīng)，洗滌后與HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG反應(yīng)，然后按照ECL試劑盒的操作說明進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)。

1.2.4 MTT法檢測(cè) FLAG-pcDNA3.0-iASPP對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖的影響 將未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞、NIH3T3-F LAG-pcDNA3.0-iASPP細(xì)胞和NIH3T3-FLAG-pcDNA3.0細(xì)胞按每孔1×103個(gè)細(xì)胞傳代于96孔板，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育4h，棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO150μL，振蕩10min。在490nm波長的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)各組吸光度（OD）值，連續(xù)檢測(cè)5d。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒FLAG-pcDNA3.0-iASPP的酶切鑒定及序列測(cè)定 3個(gè)重組質(zhì)粒FLAG-pcDNA3.0-i－ASPP樣本經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切后，0.8%瓊脂糖電泳可見2713bp的目的條帶（圖1），證明iASPP已經(jīng)成功插入到FLAG-pcDNA3.0載體中。測(cè)序結(jié)果（略）經(jīng)BLAST分析顯示與Genbank中的序列(登錄號(hào)：NM_006663.3)CDS區(qū)一致。

圖1 重組質(zhì)粒FLAG-pcDNA3.0-iASPP的雙酶切鑒定Fig1The identification of recombinant plasmid FLAG-pcDNA3.0-iASPP by restriction enzyme digestion

2.2 iASPP在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)G418持續(xù)篩選21d后形成明顯陽性克隆，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則全部死亡。將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中iASPP mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染FLAG-pcDNA3.0-iASPP組的NIH3T3細(xì)胞在297bp處可見基因iASPP的目的條帶，而未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組則未見目的條帶，表明外源iASPP可以很好轉(zhuǎn)錄（圖2）。

2.2.2 Western blotting檢測(cè)結(jié)果 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染FLAG-pcDNA3.0-iASPP的NIH3T3細(xì)胞的陽性克隆中，可檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量為99kD的目的條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組均未見iASPP蛋白表達(dá)（圖3）。

2.3 MTT法檢測(cè)FLAG-pcDNA3.0-iASPP對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖的影響 MTT比色法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組在490nm波長處的OD值，取均值繪制折線圖（圖4）。應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析顯示：轉(zhuǎn)染Flag-pcDNA3.0-iASPP組增殖速率高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值分別為0.036、0.022；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（FLAG-pcDNA3.0）增殖速率基本一致，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.974）。

圖2 RT-PCR鑒定結(jié)果Fig 2 Result of RT-PCR identification

圖3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig 3 Result of Western blotting identification

圖4 MTT法測(cè)定不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖情況Fig 4 Cell proliferation were evaluated using MTT assays among different groups

3 討論

p53凋亡刺激蛋白家族（apoptosis stimulating protein of p53，ASPP），是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最完善、積極的調(diào)控p53的基因家族，由3個(gè)成員組成：ASPP1、ASPP2和iASPP。ASPP1、ASPP2是p53蛋白的活化子，能特異性的激活p53促凋亡活性，而不影響細(xì)胞周期阻滯[7]；iASPP則抑制p53的促凋亡活性，起到類似癌基因的作用，多項(xiàng)研究指出i－ASPP在乳腺癌、白血病、肺癌、垂體瘤、肝細(xì)胞癌中存在過表達(dá)現(xiàn)象[1,5-6,8]。阻斷iASPP和p53的結(jié)合能夠恢復(fù)p53的功能，提示iASPP有望作為腫瘤治療靶點(diǎn)[9-13]。

通過iASPP基因siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P53野生型白血病細(xì)胞株Nalm6和P53基因突變型白血病細(xì)胞株K562，發(fā)現(xiàn)iASPP mRNA、蛋白表達(dá)都有所降低，細(xì)胞生長和增殖受到明顯抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡有所增加[8]。為進(jìn)一步確認(rèn)iASPP能否成為白血病治療的一個(gè)靶點(diǎn)，聯(lián)合化療藥物（柔紅霉素和依托泊苷）對(duì)這兩個(gè)白血病細(xì)胞株進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化療藥物并不影響iASPP mRNA的表達(dá)，但下調(diào)i－ASPP mRNA水平能顯著增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，這種趨勢(shì)在Nalm6細(xì)胞株中表現(xiàn)得尤為明顯。相似的一項(xiàng)研究亦發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染iASPP基因siRNA質(zhì)粒后iASPP mRNA表達(dá)有所降低，細(xì)胞凋亡有所增加，且細(xì)胞凋亡增加的程度與p53的狀態(tài)有關(guān)[14]。

本研究采用PCR的方法從源克隆PCMV-i－ASPP中擴(kuò)增獲得iASPP基因編碼區(qū)序列，并亞克隆到真核表達(dá)載體FLAG-pcDNA3.0中，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定序列正確，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可檢測(cè)到iASPP基因mRNA和蛋白水平表達(dá)。iASPP真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建使得我們?cè)谝欢ǔ潭壬峡梢粤私庠趇ASPP過表達(dá)情況下，細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)、功能的變化。與化療藥物聯(lián)合，還可以分析腫瘤耐藥的可能機(jī)制。另外，本研究亦通過用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，G418加壓篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)iASPP的細(xì)胞系，MTT法比較其與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的增殖情況，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)iASPP細(xì)胞系的增殖率明顯增高，初步驗(yàn)證了iASPP的促細(xì)胞增殖活性。

總之，iASPP真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建，是iASPP基因siRNA技術(shù)的一個(gè)重要補(bǔ)充，為進(jìn)一步開展直接、全面的研究iASPP的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。我們今后的研究重點(diǎn)應(yīng)在于探討其在腫瘤發(fā)生中的具體作用機(jī)制，進(jìn)一步分析其作為腫瘤治療新靶點(diǎn)的可行性。

［1］ Bergamaschi D,Samuels Y,ONeil NJ,et al.iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53conserved from worm to human[J].Nat Genet, 2003,33(2):162

［2］ Slee EA,Gillotin S,Bergamaschi D,et al.The N-terminus of a novel isoform of human iASPP is required for its cytoplasmic localization[J].Oncogene,2004,23(56):9007

［3］ Zhang X,Wang M,Zhou C,et al.The expression of iASPP in acute leukemias[J].Leuk Res,2005,29(2):179

［4］ Nex? BA,Vogel U,Olsen A,et al.Linkage disequilibrium mapping of a breast cancer susceptibility locus near RAI/PPP1R13L/iASPP [J].BMC Med Genet,2008,9:56

［5］ Pinto EM,Musolino NR,Cescato VA,et al.iASPP:A novel protein involvedinpituitarytumorigenesis[J].FrontHormRes,2010,38:70

［6］ Lu B,Guo H,Zhao J,et al.Increased expression of iASPP,regulated by hepatitis B virus X protein-mediated NF-kappaB activation, inhepatocellularcarcinoma[J].Gastroenterology,2010,139(6):2183

［7］ Lu X.p53:a heavily dictated dictator of life and death[J].Curr Opin Genet Dev,2005,15(1):27

［8］ Liu H,Wang M,Diao S,et al.siRNA-mediated down-regulation of iASPP promotes apoptosis induced by etoposide and daunorubicin in leukemia cells expressing wild-type p53[J].Leuk Res,2009,33(9):1243

［9］ Kobayashi S,Kajino S,Takahashi N,et al.53BP2induces apoptosis through the mitochondrial death pathway[J].Genes Cells,2005, 10(3):2530

［10］Liu ZJ,Cai Y,Hou L,et al.Effect of RNA interference of iASPP on the apoptosis in MCF-7breast ca the apoptosis activity of ncer cells[J].Cancer Invest,2008,26(9):878

［11］Robinson RA,Lu X,Jones EY,et al.Biochemical and structural studies of ASPP proteins reveal differential binding to p53,p63, and p73[J].Structure,2008,16(2):2598

［12］Deng Q,Sheng L,Su D,et al.Genetic polymorphisms in ATM, ERCC1,APE1and iASPP genes and lung cancer risk in a population of southeast China[J].Med Oncol,2010,3

［13］Gillotin S.iASPP,a potential drug target in cancer therapy[J].Leuk Res,2009,33(9):1175

［14］Liu ZJ,Xin HM,Chen J,et al.A new strategy to resume p53in leukemia cell lines retaining wild-type p53[J].Leuk Res,2007,31(8):1156