劉芳萍，李昌文，劉立新，李 睿，羅鵬志，盧斯亮，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001）

雞沙門(mén)氏菌病是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一，在雛雞中具有較高的發(fā)病率和死亡率，成年雞則嚴(yán)重影響其生產(chǎn)性能。目前主要使用抗菌藥物對(duì)該病進(jìn)行預(yù)防和治療。氟喹諾酮類藥物為一類化學(xué)合成的廣譜、高效、低毒的抗菌藥物。隨著該類藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用及不當(dāng)使用，雞沙門(mén)氏菌對(duì)其耐藥性也隨之廣泛產(chǎn)生，且耐藥率呈逐年升高的趨勢(shì)[1-3]。耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致預(yù)防和治療的失敗，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而且，耐藥性可通過(guò)食物鏈傳遞給人群，也嚴(yán)重危害著人類的健康。

研究表明，沙門(mén)氏菌對(duì)氟喹諾酮類產(chǎn)生耐藥的原因與氟喹諾酮類藥物作用的靶位-DNA旋轉(zhuǎn)酶（由gyrA和gyrB基因編碼）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（由parC和parE基因編碼）發(fā)生改變有一定的相關(guān)性。DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV各亞基上都有一與喹諾酮類藥物耐藥性產(chǎn)生有關(guān)的保守區(qū)域，稱為喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance-determining region，QRDR），此區(qū)域內(nèi)的基因突變導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸變異是引起喹諾酮類藥物耐藥的關(guān)鍵因素[4-5]。關(guān)于DNA旋轉(zhuǎn)酶與氟喹諾酮類藥物耐藥性的關(guān)系已有另文詳述[6]。本文針對(duì)臨床分離的9株對(duì)5種氟喹諾酮類藥物（環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、單諾沙星和沙拉沙星）耐藥水平較高的雞源性沙門(mén)氏菌拓?fù)洚悩?gòu)酶IV進(jìn)行研究，分析耐藥基因突變與耐藥性產(chǎn)生的關(guān)系，探討雞源性沙門(mén)氏菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制，為進(jìn)一步研究沙門(mén)氏菌的耐藥機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

質(zhì)控菌株:雛雞沙門(mén)氏菌NCTC5776，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

試驗(yàn)菌株:雞源性沙門(mén)氏菌氟喹諾酮類耐藥株37、38、42、55、60、61、68、217和251，由齊齊哈爾、吉林、雙城等地的病雞糞便樣本分離所得。

1.2 藥品與試劑

pMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和HindⅢ、蛋白酶K、反轉(zhuǎn)錄酶、DNAmarker DL2000等均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

圖1 parC基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of parC gene

根據(jù)GenBank中鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2全基因序列，上游引物parCF:5′TAA TGA GCG ATA TGG CAG AG 3′，下游引物 parCR:5′GGT AAC ATT TTC GGT TCC TG 3′，引物位于parC基因序列的14～469bp；上游引物 parEF:5′TAA TCG GAC CGA GCT GTT CC 3′，下游引物 parER:5′TGC ATC GGG TTC ATT TCT CC 3′，引物位于parE基因序列的1227～1699bp處。擴(kuò)增的區(qū)域涵蓋了氟喹諾酮類藥物耐藥性決定區(qū)（QRDR）。

1.4 parC基因和parE基因的擴(kuò)增

PCR體系25μL:染色體DNA 1.0μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2.5μL，dNTPs Mixture（各 2.5 mmol·L-1）2.0μL，上下游引物（10 pmol·μL-1）各0.5μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2μL。parC 基因的PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃熱啟動(dòng)10 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育10 min。parE基因的PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃熱啟動(dòng)10 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析

PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后，克隆到pMD18-T載體上。提取質(zhì)粒，用Eco RⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定。

由上海聯(lián)合基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)得的核苷酸序列用DNASIS和DNAmaN軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)氏菌parC基因和parE基因片段擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增parC基因片段大小為475bp，擴(kuò)增parE基因片段大小為492bp。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1、2，在500～750bp處出現(xiàn)特異的目的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小基本一致。

圖2 parE基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification product of parE gene

2.2 parC基因測(cè)序結(jié)果及分析

臨床分離雞源性沙門(mén)氏菌氟喹諾酮類耐藥菌株與質(zhì)控菌株和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2株parC基因片段核苷酸序列比較見(jiàn)表1。

9株臨床分離耐藥株與質(zhì)控菌株和LT2株的parC基因QRDR的核苷酸及氨基酸序列完全相同。

2.3 parE基因測(cè)序結(jié)果及分析

臨床分離雞源性沙門(mén)氏菌氟喹諾酮類耐藥菌株與質(zhì)控菌株和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2株parE基因片段核苷酸序列比較見(jiàn)表2。

表1 10株雞源沙門(mén)氏菌parC基因核苷酸序列與鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2株比較Table1 Nucletide sequence comparing of parC genes between ten chicken origins and Salmonella typhimurium LT2

表2 10株雞源沙門(mén)氏菌parE基因核苷酸序列與鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2株比較Table2 Nucletide sequence comparing of parE genes between ten chicken origins and Salmonella typhimurium LT2

質(zhì)控菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2的parE基因QRDR的核苷酸序列有幾處不同，包括C-1341→T、G-1347→A、A-1380→G、C-1527→T、A-1569→G。與質(zhì)控菌株相比，9株臨床分離得到的雞源性沙門(mén)氏菌氟喹諾酮類耐藥株中菌株37、55和60的parE基因QRDR發(fā)生單堿基突變，包括菌株37的T-1434→C、菌株55的T-1434→C和菌株60的T-1517→C，此外菌株55的parE基因第1341位為C、第1380位為A，與NCTC5776不同，但與LT2相同。

利用DNAmaN軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2的氨基酸序列進(jìn)行比較分析。質(zhì)控菌株與LT2的parE基因的QRDR的氨基酸序列完全相同；與質(zhì)控菌株相比，9株臨床分離耐藥株中只有60的parE基因第506位氨基酸發(fā)生F→S（Phe→Ser）取代，且位于QRDR內(nèi)，其余菌株的氨基酸均未發(fā)生變化。

3 討論與結(jié)論

氟喹諾酮類藥物作用于革蘭氏陰性菌的首選靶位是DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrA、gyrB基因），革蘭氏陽(yáng)性菌的首選靶位是拓?fù)洚悩?gòu)酶IV（parC、parE基因，金黃色葡萄球菌是grlA、grlB基因）。酶的作用機(jī)制是大腸桿菌、金葡球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌和支原體等病原微生物對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制。

Guerra等從牛體內(nèi)分離得到的對(duì)萘啶酸和環(huán)丙沙星耐藥的沙門(mén)氏菌中，有一株parC基因發(fā)生了Ser80→Ile取代[7]。Baucheron等報(bào)道缺失parC基因Ser80→Ile改變能使耐藥鼠傷寒沙門(mén)氏菌DT204對(duì)氟喹諾酮類的敏感性增加16～32倍[8]。魏秀麗等對(duì)沙門(mén)氏菌DNA旋轉(zhuǎn)酶在氟哇諾酮類藥物作用壓力下發(fā)生突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)[9]，在gyrA基因83和87位雙位點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上，parC基因在80位還發(fā)生Ser被Arg或lIe代替，加重耐藥性的增長(zhǎng)，因此parC基因可能也是氟哇諾酮類藥物的作用位點(diǎn)。Reche等試驗(yàn)了7株對(duì)萘啶酸高度耐藥的沙門(mén)氏菌，所有菌株的parC基因未發(fā)生任何突變，因而得出parC基因突變對(duì)于獲得高水平萘啶酸耐藥株是不必要的[10]。Luke等的研究也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變僅出現(xiàn)在parC基因這一現(xiàn)象[11]。本試驗(yàn)中質(zhì)控菌株和9株臨床分離株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2株parC基因QRDR的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均為100%。這表明，parC基因在沙門(mén)氏菌對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性中并不占主導(dǎo)地位。

本試驗(yàn)中質(zhì)控菌株與LT2的parE基因QRDR的氨基酸序列同源性為100%，9株臨床分離雞源性沙門(mén)氏菌氟喹諾酮類耐藥株中只有菌株60的parE基因第506位氨基酸發(fā)生F→S（Phe→Ser）取代，位于QRDR區(qū)域內(nèi)，與質(zhì)控菌株parE基因QRDR的氨基酸的同源性為99.4%，其余菌株與質(zhì)控菌株parE基因QRDR的氨基酸的同源性均為100%。關(guān)于氟喹諾酮類耐藥沙門(mén)氏菌parE基因發(fā)生突變未見(jiàn)報(bào)道。Giraud等用恩諾沙星通過(guò)體外和體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生沙門(mén)氏菌耐藥株來(lái)分析耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，分析結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)gyrB、parC、parE基因的突變。Hirose等對(duì)從1995年到2001年從病人血液或分泌物中分離得到的氟喹諾酮類耐藥腸炎沙門(mén)氏菌的gyrA、gyrB、parC、parE基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)所有菌株的gyrB和parE基因均未發(fā)生突變[12]。Piddock對(duì)人源性和可食動(dòng)物源性氟喹諾酮類耐藥腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行研究，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)parC、parE基因的突變位點(diǎn)[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)的菌株60的parE基因QRDR第506位氨基酸的變異與耐藥水平之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

本研究克隆了parC和parE基因的QRDR，序列分析結(jié)果表明，所有耐藥株的parC基因均未發(fā)生任何氨基酸改變，只有菌株60的parE基因發(fā)生Phe506→Ser氨基酸取代。本次研究表明，parE基因突變與耐藥性雖有一定的關(guān)系，但拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的作用機(jī)制可能并不是沙門(mén)氏菌對(duì)氟喹諾酮類耐藥的主要機(jī)制，沙門(mén)氏菌對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，還存在其他的耐藥機(jī)制。

[1]王貴升,田夫林,陳靜,等.山東省小規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)沙門(mén)氏菌流行病學(xué)調(diào)查分析[J].家禽科學(xué),2007(5):11-13.

[2]陳希文,王雄清,代敏,等.綿陽(yáng)地區(qū)部分雞場(chǎng)雞白痢沙門(mén)氏桿菌的耐藥性分析[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2007(6):8-9.

[3]趙連生.雞源沙門(mén)氏菌的分離鑒定、耐藥性檢測(cè)及耐藥基因定位[D].重慶:西南大學(xué),2009:3-8.

[4]Giraud E,Brisabois A,martel J L,et al.Comparative studies of mutations in animal isolates and experimental in vitro-and in vivo-selected mutants of Salmonella spp.suggest a counter selection of highly fluoroquinolone-resistant strains in the field[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1999,43(9):2131-2137.

[5]Corinna K,Sonja F,Annode J.Identification of the plasmid-borne quinolone resistance gene qnrS in Salmonella enterica serovar Infantis[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2006,58(l):18-22.

[6]劉芳萍,曲鵬,劉立新,等.雞源性沙門(mén)氏菌DNA旋轉(zhuǎn)酶與耐氟喹諾酮類藥物關(guān)系研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(8):645-648.

[7]Guerra B,malorny B,Schroeter A,et al.Mutiple resistance mechanisms in fluoroquinolone-resistant Salmonella isolates from Germany[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2003,47(6):2059.

[8]Baucheron S,Chaslus-dancla E,Cloeckaert A.Role of TolC and parC mutation in high-level fluoroquinolone resistance in Sal-monella enterica serotype Typhimurium DT204[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2004(53):657-659.

[9]魏秀麗,陳杖榴.沙門(mén)氏菌耐藥株gyrA基因和parC基因突變特征分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2006,42(9):6-8.

[10]Reche MP,Jose E,Pedro A,et al.GyrA mutations associated with Nalidixic Acid-resistant Salmonella from wild birds[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2002,46(9):3108-3109.

[11]Luke P R,Deborah J E,Sue W C,et al.Fluoroquinolone treatment of experimental Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 infections in chickens selects for both gyrA mutations and changes in efflux pump gene expression[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2005,56(2):297-306.

[12]Hirose K,Hashimoto A,Tamura K,et al.DNA Sequence analysis of DNA Gyrase and DNA topoisomerase IV quinolone resistance-determining regions of Salmonella enterica Serovar Typhi and Serovar Paratyphi A[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2002,46(10):3249-3252.

[13]Piddock L J.Fluoroquinolone resistance in Salmonella serovars isolated from humans and food animals[J].FEMS Microbiol Rev,2002,26(1):3-16.