雙 寶，李 明，李 慧，矯洪濤，王 晴，劉忠華，向文勝*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學司法鑒定中心，哈爾濱 150030）

白細胞介素-1（IL-1）是最早被發(fā)現(xiàn)的細胞因子之一，人們對它的認識已有三十多年了[1]。隨著分子生物學和現(xiàn)代免疫學的發(fā)展，人們對IL-1的認識也在不斷加深。目前認為IL-1不僅僅具有十分重要的免疫調(diào)節(jié)作用，而且和許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有著十分密切的關(guān)系。特別是作為炎癥反應(yīng)中的一個關(guān)鍵因子，它在各類炎性疾病中的作用更不容忽視。大量的研究結(jié)果表明，人類的許多疾病都伴有局部或全身的IL-1水平升高[2-5]。IL-1Ra是第一個被發(fā)現(xiàn)的天然存在的細胞因子拮抗劑，是體內(nèi)天然存在的拮抗IL-1生物活性的一種糖蛋白，由152個氨基酸組成，具有與IL-1Beta相似的結(jié)構(gòu)，但結(jié)合于IL-1受體后不會引起IL-1效應(yīng)[6]。它為人類進一步了解細胞網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機制提供了新的思路。而其獨特的生物學活性，為人類征服由于IL-1異常升高而導(dǎo)致的各類疾病提供了新的治療手段。

本試驗克隆、表達了IL-1Ra，為IL-1Ra重組菌的高密度發(fā)酵提供了菌株，為IL-1Ra的進一步研究應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 胎盤組織

取新鮮的胎盤組織（由哈爾濱醫(yī)科大學提供），總量200 mg。取出后置-70℃保存，一周內(nèi)使用。

1.2 菌株和質(zhì)粒

pGEM-T vector（購于Promega公司）；pBV220質(zhì)粒載體和菌株E.coli XL1-Blue及E.coli DH5α是本實驗室保存。

1.3 工具酶和試劑

總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent、RT-PCR一步反應(yīng)試劑盒（購自GIBCO-BRL公司）；DEPC（購自Invitrogen公司）；DNAmarker DL2000（購自大連寶生物）；pp20-低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker II（購自Tiangen博邁德生物）；其他試劑均為Sigma公司或國產(chǎn)分析純生化試劑。

1.4 PCR引物

根據(jù)已報道的人IL-1Ra基因序列g(shù)i:32576的成熟肽設(shè)計PCR引物，引物在上海生工合成。其中5′引物中導(dǎo)入Eco RⅠ酶切位點，3′引物中導(dǎo)入PstⅠ酶切位點（劃線部分）。

1.5 胎盤組織總RNA的制備

取胎盤組織100 mg放入1.5mL EP管中，加入1mL TRIzol溶液，冰浴中勻漿數(shù)次后靜置5 min，2～8 ℃ 12000 r·min-1離心10 min，取下層勻漿液移至新EP管中加入200μL氯仿，快速震蕩15 s后室溫放置3 min，2～8 ℃ 11000 r·min-1離心15 min，吸取水相，加入500μL異丙醇，混勻后室溫放置10 min，2～8 ℃ 11000 r·min-1離心10 min，75%乙醇1mL洗滌沉淀，2～8 ℃ 7500 r·min-1離心5 min，棄乙醇真空抽干，溶于20μL無RNA酶的水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）

取5μL所提取的胎盤組織總RNA為模板，利用RT-PCR一步反應(yīng)試劑盒進行RT-PCR。

RT-PCR反應(yīng)體系（50μL）:2×Reaction Mix 25μL、 5'引 物（10μmol·L-1）1μL、 3'引 物（10μmol·L-1）1μL、RT/Taq Mix 1μL、模板 5μL、加水到50μL。

反應(yīng)步驟:50℃反應(yīng)20 min；94℃2 min后進入以下程序:變性94℃15 s，退火55℃30 s，72℃延伸45 s，擴增35個循環(huán)后72℃延伸15 min。

1.7 RT-PCR產(chǎn)物回收

依照鼎國生物工程公司DNA片段快速回收試劑盒操作說明進行。

1.8 測序質(zhì)粒構(gòu)建

將獲得的人IL-1Ra基因PCR回收產(chǎn)物連入測序載體中。

連接反應(yīng)體系（10μL）:pMD18-T Vector 1μL、純化的IL-1Ra PCR產(chǎn)物4μL、SolutionⅠ 5μL。以上連接體系16℃反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細菌，37℃培養(yǎng)過夜。

1.9 表達質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將測序正確的pGEM-IL-1Ra質(zhì)粒和大腸桿菌pBV220載體質(zhì)粒用Eco RⅠ、PstⅠ進行雙酶切，37℃酶切過夜，回收片斷，進行片斷連接；轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細胞后提取質(zhì)粒，通過PCR和Eco RⅠ-PstⅠ雙酶切鑒定。

1.10 重組蛋白誘導(dǎo)表達

將經(jīng)PCR和Eco RⅠ-PstⅠ雙酶切鑒定正確的pBV220-IL-1Ra陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑取單克隆分別接種含100μg·mL-1氨芐青霉素（Amp）的液體LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)6 h后，42℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。陰性對照為在同等條件下30℃培養(yǎng)的菌體，具體制樣過程見1.11。

1.11 SDS-PAGE樣品的制備

取0.6mL誘導(dǎo)后及對照的菌懸液，12000 r·min-1離心收集菌體，棄上清，用0.05mL的蒸餾水懸浮菌體，加入等體積的2倍上樣緩沖液，輕輕混勻，沸水浴10 min，瞬時離心，取上清用作上樣樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 人IL-1Ra基因的克隆

以人胎盤組織中所提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)一條長度約460bp的DNA擴增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符（見圖1）?；厥誖T-PCR產(chǎn)物，與pGEM Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，中間載體命名為pGEM-IL-1Ra。采用PCR（見圖2）和Eco RⅠ-PstⅠ酶切（見圖3）方法鑒定，取1個含有插入片斷的陽性克隆。

圖1 RT-PCR的結(jié)果Fig.1 Result of RT-PCR

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR assay of recombinant plasmid

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Digest assay of recombinant plasmid by Eco RⅠ-PstⅠ

2.2 測序得到的結(jié)果及軟件預(yù)測

用pGEM Vector的上游通用M13-47引物進行測序（由上海生工完成），結(jié)果見圖4。

測序結(jié)果與基因序列g(shù)i:32576完全一致。該基因可編碼152個氨基酸的蛋白質(zhì)序列，通過軟件DNAmaN預(yù)計蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為17 ku。總氨基酸數(shù):152，分子質(zhì)量=17089 ku，最大開放閱讀框起始于152氨基酸（456堿基）氨基酸位點1（或DNA位點1）。

圖4 測序結(jié)果Fig.4 Sequence result

2.3 原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將pGEM-IL-1Ra和表達載體pBV220用Eco RⅠ-PstⅠ消化后膠回收，連接、轉(zhuǎn)化，重組載體命名為pBV220-IL-1Ra。PCR鑒定出陽性質(zhì)粒pBV220-IL-1Ra兩個（見圖5），再用雙酶切鑒定確定了這2個確為陽性質(zhì)粒（見圖6）。

圖5 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.5 PCR assay of recombinant plasmid

圖6 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.6 Digest assay of recombinant plasmid by Eco RⅠ-PstⅠ

2.4 重組人IL-1Ra蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達

將質(zhì)粒pBV220-IL-1Ra轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆接種到含100μg·mL-1氨芐青霉素（Amp）的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)6 h后，42℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況，鑒定表達產(chǎn)物。陰性對照為在同等條件下30℃培養(yǎng)的菌體。通過SDS-PAGE檢測目的蛋白占菌體總蛋白的情況。由圖6可知，誘導(dǎo)后的菌體蛋白在分子質(zhì)量18 ku左右處有一特異性表達帶，與預(yù)期的17 ku相符，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體蛋白在相應(yīng)位置上沒有特異性蛋白條帶，說明我們將目的基因在原核生物中成功表達。再通過成像系統(tǒng)的灰度分析，我們得出，表達的目的蛋白占總蛋白的20%左右。

圖7 表達蛋白SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of expression protein

3 討論

細胞因子一直是人們研究的熱點。2009年朱慧萌等研究了人白細胞介素17及其家族[7]。同年，姜文博等研究了雞IL-18基因的克隆表達[8]。IL1-Ra可以與IL1競爭受體從而緩解炎癥反應(yīng)，有望成為治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)膜炎以及其他各種炎癥的新型藥物。所以摸索出一套大量制備IL1-Ra從而用于臨床試驗的方法十分重要。在國內(nèi)，許多學者都對IL1-Ra進行了大量研究。李逸松等研究了人白細胞介素-1受體拮抗劑基因轉(zhuǎn)染人顳頜關(guān)節(jié)軟骨細胞的基因表達[9]，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有白細胞介素-1受體拮抗劑基因的細胞與正常細胞相比有一定差異，但是關(guān)于該蛋白在真核細胞中的表達量和表達后對細胞的具體意義卻缺乏探討。李樹剛等對人白細胞介素-1受體拮抗劑蛋白進行了初步的分離純化及包涵體的變復(fù)性[6]，結(jié)果得到了有部分活性的蛋白，然而他們對菌株的信息和誘導(dǎo)的方法描述不夠。張學述對人白細胞介素-1受體拮抗劑進行和克隆和表達，但是蛋白的表達量不是很理想[10]。

本研究采用RT-PCR技術(shù)人從胎盤組織提取總RNA，克隆到了人IL1-Ra cDNA，序列分析顯示與其他學者的研究結(jié)果相同。構(gòu)建了表達質(zhì)粒pBV220-IL1-Ra。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)30℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測所獲得的目的蛋白與預(yù)期一致，目的蛋白的表達效率在20%以上，得到了IL1-Ra高產(chǎn)菌株。這就為IL1-Ra的大量制備提供了前提。雖然原核表達的真核蛋白缺少一些特定位點的糖基化，但是只影響蛋白部分的活性[6]，所以本研究結(jié)果為通過高密度發(fā)酵大量制備IL1-Ra以及IL1-Ra的進一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文以人胎盤組織為材料，以從中所提取的總RNA為模板，通過RT-PCR克隆了IL1-Ra成熟肽的編碼基因，總大小為456bp，其測序結(jié)果與基因序列g(shù)i:32576完全一致。將該基因重組表達于大腸桿菌中后，得到了大小約為18 ku的蛋白質(zhì)，與推測的17 ku相符，經(jīng)灰度比較發(fā)現(xiàn)該蛋白約占菌體總蛋白的20%左右。

說明我們成功的在大腸桿菌中高效表達了IL1-Ra，為IL-1Ra的進一步研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]畢愛華.醫(yī)學免疫學[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,1995:68-70.

[2]Leonardi A,Borghesan F,DePaoli M,et al.Procollagens and infla-mmatory cytokine concentrations in tarsal and limbal vernal kera-toconjunctivitis[J].Exp Eye Res,1998,67(1):105-112.

[3]Sotozono C,He J,matsumoto Y,et al.Cytokine expression in the alkali-burned cornea[J].Cull Eye Res,1997,16(7):670-676..

[4]Shams N B,Reddy C V,Watanabe K,et al.Increased interleukin-1 activity in the injured vitamin A-deficient cornea[J].Cornea.1994,13(2):156-166..

[5]Black R A,Kronheim S R,Sleath P R.Activation of interleukin-1 beta by a co-induced protease[J].FEBS Lett.1989,247:386-390.

[6]李樹剛,鄧小燕,趙洪,等.用包涵體復(fù)性的方法制備重組人白細胞介素-1受體拮抗劑[J].生物醫(yī)學工程學雜志,2007,24(5):1128-1132.

[7]朱慧萌,李德山.白細胞介素17及其家族[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(11):137-140.

[8]姜文博,孫進華,單安山.雞IL-18基因的克隆表達及對新城疫疫苗誘導(dǎo)的HI抗體變化的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(5):75-79.

[9]李逸松,田衛(wèi)東,李聲偉,等.人白細胞介素-1受體拮抗劑基因轉(zhuǎn)染人顳頜關(guān)節(jié)軟骨細胞的基因表達[J].華西口腔醫(yī)學雜志,2006,24(4):300-302.

[10]張學述.人白細胞介素1受體拮抗劑cDNA克隆及其表達影響因素[J].微生物學免疫學進展,1999,27(2):25-27.