于新凱，石鵬超，左 群

骨骼肌損傷修復(fù)是一個極其復(fù)雜的過程，多年來一直將骨骼肌細(xì)胞視為終末分化細(xì)胞，但是，衛(wèi)星細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)推動了骨骼肌再生研究的飛速發(fā)展。衛(wèi)星細(xì)胞是位于肌膜與基底膜之間的一組細(xì)胞群，是肌肉損傷后修復(fù)的惟一來源，其修復(fù)伴隨著復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，與大量的生長因子相關(guān)，生長因子是一類影響細(xì)胞生長活性的多肽因子，其對刺激衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)組織或器官修復(fù)和再生具有重要作用[16]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming Grow th Factor-β，TGF-β）是一種多功能的細(xì)胞生長因子，分布于各類型的細(xì)胞和組織中，它不僅影響胚胎發(fā)育、骨的形成、血管再生、炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，而且，對細(xì)胞的生長、分化、凋亡和免疫功能也有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。哺乳動物體內(nèi)TGF-β共有3種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中，TGF-β1所占比例最高（＞90％），活性最強(qiáng)[2]。目前研究認(rèn)為，TGF-β可以影響骨骼肌損傷修復(fù)的生長因子，在衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過程中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[13，18，20]。

但已有的研究大多集中于觀察離體細(xì)胞培養(yǎng)過程中TGF-β的作用和變化，在體研究較少。本研究擬通過建立運動性骨骼肌損傷實驗動物模型，觀察損傷后不同時刻肌肉內(nèi) TGF-β1的變化，研究骨骼肌損傷修復(fù)過程中 TGF-β1的變化特征，從而進(jìn)一步探究骨骼肌損傷后的修復(fù)過程，豐富運動性骨骼肌損傷修復(fù)理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡雄性SD大鼠72只，購于上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，體重264.44±11.94 g，分籠飼養(yǎng)，室溫20℃±2℃，相對濕度50％～55％，光照時間12 h，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物固體干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食。大鼠經(jīng)過跑臺適應(yīng)訓(xùn)練后按體重隨機(jī)分為對照組（C組）、運動后即刻組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、72 h組、1周組、2周組。

1.2 運動損傷模型和實驗取材

除C組外，其余各組大鼠進(jìn)行一次90 min持續(xù)跑臺訓(xùn)練，速度為16 m/min，坡度為-16°，分別在運動后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周等不同時刻處死、取材。

大鼠采用10％水合氯醛淺麻后，迅速取雙側(cè)腓腸肌，左側(cè)腓腸肌液氮速凍后置于-80℃低溫冰箱保存待用，用于RT-PCR分析；右側(cè)腓腸肌置于4％多聚甲醛固定液中固定，制作石蠟切片，進(jìn)行 HE和免疫組織化學(xué)染色。

1.3 TGF-β1m RNA的RT-PCR測定

取凍存左側(cè)腓腸肌置于玻璃勻漿器中，加1 m l Trizol，充分勻漿，靜至5 min后，取上清移至1.5 m l Eppendo rf管，室溫放置 10 min，加 200μl氯仿，充分混勻， 15 000 rpm離心5～7 min，取上清至1.5 m l Eppendorf管加600μl氯仿混勻，15 000 rpm離心5 min；取上清至1.5 m l Eppendo rf管加500μl異丙醇混勻，15 000 rpm離心10 min，棄上清，用75％乙醇1 m l沖洗，高速離心5 min，棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥（2～3 min）；將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中，將總RNA作適當(dāng)稀釋后，分光光度計測OD 260/OD 280比值，并定量。定量公式：RNA濃度（μg/m l）=OD 260值×40×稀釋倍數(shù)（400倍）。

按下列順序在1.5 m l離心管中加入下列反應(yīng)物（體積為12.5μl）：DEPC水6μl、RNA酶抑制劑（50 U/μl） 0.5μl、隨機(jī)引物（50 pM/μl）2μl、RNA（2μg），在65℃水浴處理5 min后室溫放置10 min，高速離心5 s，按下列順序加在1.5 m l離心管加入下列反應(yīng)物（總體積為20 μl）：RNA酶抑制劑（50U/μl）0.5μl、5×buffer（Promega） 4μl、dN TP M IX（10mM/each）2μl、DTT2μl、M-MLV （200 U/μl）1μl，水浴37℃下反應(yīng)1 h，90℃處理 5～10 min后冰浴5 min，高速離心5 s。

PCR反應(yīng)體系（50μl）：H2O：34.5μl，MgCl2（TaKa-Ra）5μl，10×buffer（TaKaRa）、dNTP（10mM/each）、Primer（up50 pM/ul）、Primer（dow n50 pM/μl）各 1μl， Temp late（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即cDNA）2μl，Taq（5U/μl）0.6 μl（3 U）。反應(yīng)條件：95℃2 min，94℃30s、60℃45s、72℃1 min，共38個循環(huán)，72℃6 min。內(nèi)參選用 GAPDH。

表1 引物序列、產(chǎn)物長度一覽表

產(chǎn)物電泳和分析：TBE緩沖液，1.2％的瓊脂糖電泳，電壓為160 V，55 min，利用系列數(shù)碼凝膠圖象處理系統(tǒng)GIS-2008和圖象分析軟件分析。

1.4 腓腸肌 HE染色

將右側(cè)腓腸肌后固定24 h以上后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作石蠟切片，切片厚度為5μm。

將切片脫蠟至水，浸入蘇木素中染色5 min，自來水沖洗3 min，1％稀鹽酸酒精分化2～3 s，自來水沖洗3 min，伊紅染色3 min，流水沖洗3 min，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察腓腸肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，拍照并采集圖像。

1.5 TGF-β1免疫組化染色和圖像采集

切片常規(guī)脫蠟至水，3％H2O2室溫孵育20 min，PBS （p H 7.4）洗3次，每次2 min；PBS（p H 7.0）抗原熱修復(fù)， PBS（p H 7.4）洗1次5 min；滴加5％山羊血清封閉液，室溫孵育20 min；滴加一抗，4℃濕盒孵育過夜，PBS（p H 7.4）洗3次，每次5 min；滴加二抗，37℃濕盒孵育20 min，PBS （p H 7.4）洗4次，每次5 min；滴加 SABC，37℃濕盒孵育20 min；DAB顯色；蘇木精輕度復(fù)染，鏡檢，拍照并采集圖像。

隨機(jī)抽取每組大鼠腓腸肌 TGF-β1免疫組織化學(xué)反應(yīng)染色切片，每組5張。采用光學(xué)顯微鏡Olympus DX70和Image-Pro Plus 4.1圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和分析處理。每張切片隨機(jī)各取5個視野，每組共測25個視野，在同一放大倍數(shù)下測定免疫陽性表達(dá)面積和積分光密度（Integrated Optical Density，IOD）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 研究結(jié)果

2.1 各組大鼠腓腸肌TGF-β1mRNA RT-PCR結(jié)果

表2顯示，一次下坡跑后大鼠腓腸肌 TGF-β1mRNA除72 h組外，其余各組均低于對照組，其中24 h和2周組顯著性低于對照組（P＜0.05），其余均與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腓腸肌TGF-β1m RNA表達(dá)水平一覽表

2.2 各組大鼠腓腸肌 HE染色結(jié)果

圖1 各組大鼠腓腸肌HE染色結(jié)果圖 ×400

HE染色可見，C組肌膜完整、清晰，肌纖維結(jié)構(gòu)正常； 0 h組肌纖維略腫脹，肌纖維形態(tài)無明顯變化；6 h組肌纖維腫脹明顯，部分肌纖維呈圓形；12 h組肌纖維持續(xù)腫脹，部分肌纖維溶解，肌膜模糊，不連續(xù)；24 h組肌纖維部分?jǐn)嗔眩猩倭垦装Y細(xì)胞浸潤；48 h組炎癥細(xì)胞明顯增多；72 h組大量炎癥細(xì)胞浸潤；1周組偶見炎癥細(xì)胞浸潤，肌纖維無明顯腫脹；2周組肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肌膜完整性良好（圖1）。

2.3 各組大鼠腓腸肌 TGF-β1免疫組織化學(xué)結(jié)果

表3 各組大鼠腓腸肌TGF-β1免疫組化圖像采集分析結(jié)果一覽表

免疫組化染色結(jié)果可見，對照組和實驗組大鼠腓腸肌TGF-β1染色均為陽性，棕褐色或棕黃色的顆粒主要分布在細(xì)胞質(zhì)。經(jīng)蘇木精復(fù)染后，細(xì)胞核被染成淡藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)和其他部位不著色，用PBS代替一抗的相鄰陰性對照切片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無陽性表達(dá)結(jié)果（圖2）。

表3、圖2的免疫組化結(jié)果顯示，與C組相比，0 h組、6 h組、72 h組、2周組 TGF-β1免疫陽性染色面積減少，積分光密度值降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；12 h組、24 h組、48 h組、1周組的陽性染色面積減少，積分光密度值降低，差異不具有顯著性（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠腓腸肌 TGF-β1免疫組織化學(xué)結(jié)果圖 ×1 000

3 討論

運動性骨骼肌損傷是一種高強(qiáng)度和/或長時間運動后發(fā)生的骨骼肌損傷。研究表明，人體在經(jīng)歷一次劇烈且不習(xí)慣的運動后肌肉會出現(xiàn)肌力下降、運動范圍減小、肌肉酸痛等一系列現(xiàn)象，并且這些現(xiàn)象在第一次離心運動后表現(xiàn)更加明顯。本研究的首要目的是準(zhǔn)確建立運動性損傷的動物模型，基于此我們采用了經(jīng)典的A rmstrong下坡跑運動模型，在運動時間和動物分組方面做了一定的調(diào)整。

通過 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運動后即刻大鼠腓腸肌肌纖維出現(xiàn)腫脹趨勢；6 h組肌纖維發(fā)生明顯腫脹現(xiàn)象，部分肌細(xì)胞呈圓形，面積增加，且局部可見細(xì)胞核增多，這表明骨骼肌損傷已經(jīng)發(fā)生；12 h～72 h時間段內(nèi)肌纖維持續(xù)腫脹，肌纖維細(xì)胞核增多，局部肌纖維橫紋模糊，肌纖維邊緣不清，大量炎癥細(xì)胞浸潤，偶見小片狀肌纖維溶解等現(xiàn)象；損傷發(fā)生1周后肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常；2周后，可見肌纖維形態(tài)基本恢復(fù)正常。形態(tài)學(xué)觀察可看出，本實驗動物模型基本上反映了運動性骨骼肌損傷修復(fù)的全過程。

一般認(rèn)為，骨骼肌損傷后，衛(wèi)星細(xì)胞即被激活，開始肌肉再生過程。衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化受到正性和負(fù)性兩類生長因子的調(diào)控，骨骼肌損傷發(fā)生后，各類生長因子通過整體協(xié)同效應(yīng)調(diào)節(jié)骨骼肌再生修復(fù)。

胰島素樣生長因子（IGF），生肌決定因子（M yoD），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），肝細(xì)胞生長因子（HGF）等是典型的正性調(diào)節(jié)因子。動物實驗也表明骨骼肌損傷后，影響衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的正性調(diào)節(jié)因子有很高的表達(dá)：李宏云等[1]在骨骼肌鈍挫傷后發(fā)現(xiàn) IGF-ImRNA表達(dá)明顯升高；肖衛(wèi)華等[4]報道，小鼠腓腸肌鈍挫傷后，1～7天內(nèi)MGFmRNA表達(dá)水平持續(xù)升高，第11天時仍明顯高于對照組；向崢等[3]發(fā)現(xiàn)，bFGFmRNA在運動性骨骼肌損傷中明顯升高；Tatsumi[22]發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷后，衛(wèi)星細(xì)胞很快被激活，HGF表達(dá)明顯增加。

TGF-β則是影響衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Ronald E Allen[20]對成熟大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以同時抑制衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，而衛(wèi)星細(xì)胞的分化受 TGF-β濃度影響較其增殖更為敏感，表現(xiàn)為較低濃度的 TGF-β即可對衛(wèi)星細(xì)胞的分化產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)。Marcia R Hathaway等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，0.05～0.3 ng/ml的 TGF-β1可以對豬和牛的衛(wèi)星細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)受到其他生長因子的影響。Douglas R Cook[13]在研究中觀察到，TGF-β1單獨使用可以抑制豬衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，而 TGF-β1和FGF，IGF-I聯(lián)合使用則可以促進(jìn)豬衛(wèi)星細(xì)胞的增殖；國內(nèi)學(xué)者黎煒英等[2]也發(fā)現(xiàn)，bFGF和 TGF2β聯(lián)合作用對體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖起了重要作用。在骨骼肌疾病和損傷中，TGF-β對結(jié)締組織增殖和纖維化起決定性作用，以往對 TGF-β的研究以體外細(xì)胞培養(yǎng)，TGF-β與器官的纖維化等為主，而對 TGF-β在運動性骨骼肌損傷中作用和變化的研究較少。

本研究對骨骼肌損傷修復(fù)過程中 TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)進(jìn)行了綜合研究和分析。RT-PCR結(jié)果顯示，在運動后各組中除72h組外其余各組TGF-β1mRNA表達(dá)水平均低于對照組；免疫組化染色結(jié)果顯示，TGF-β1陽性為棕褐色或棕黃色顆粒，主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與前人研究結(jié)果[9]是一致的，與對照組相比，運動后各組蛋白表達(dá)量均下降。結(jié)果提示，盡管 TGF-β1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)變化不完全一致，但整體都較對照組呈下降趨勢，說明 TGF-β1的表達(dá)在骨骼肌損傷修復(fù)過程中受到明顯抑制。對照組中TGF-β1mRNA和蛋白均有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，這說明 TGF-β1在維持機(jī)體正常功能和形態(tài)方面可能是不可缺少的。

正常生理狀態(tài)下衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，肌肉損傷時被激活進(jìn)入分裂期，不斷增殖，融合為肌管，最后分化為成熟的肌纖維[7]。一般認(rèn)為，衛(wèi)星細(xì)胞在損傷后2～3天內(nèi)廣泛增殖，在損傷發(fā)生3天以后衛(wèi)星細(xì)胞退出細(xì)胞周期，或自我更新，或開始分化形成具有中央細(xì)胞核的肌管[14，17，19，21]。

本研究中一次下坡跑后0～72 h免疫組化結(jié)果顯示， TGF-β1表達(dá)水平較對照組呈下降趨勢，該時間段內(nèi)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞主要處于活躍的增殖期，運動后即刻 TGF-β1蛋白的表達(dá)迅速下降超過1/3，反映了在運動性骨骼肌損傷后TGF-β1的表達(dá)是受到明顯抑制的，TGF-β1mRNA的表達(dá)情況類似：各組的表達(dá)大多降低，其低值出現(xiàn)在運動后24 h，表達(dá)量不足對照組的一半，TGF-β1的低水平表達(dá)，可能與 TGF-β1受到其他正性調(diào)節(jié)因子的抑制效應(yīng)有關(guān)，本課題組的另外研究發(fā)現(xiàn)，在該時間段內(nèi)調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞增殖的正性調(diào)節(jié)因子水平較對照組明顯升高。此外， TGF-β1蛋白表達(dá)的迅速下降也可能與運動損傷引起TGF-β1外漏有關(guān)。作為一種小分子的蛋白多肽，TGF-β1在肌纖維損傷后，由于細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)很容易外漏進(jìn)入其他組織和血液中。Czarkow ska-Paczek B采用酶聯(lián)免疫法檢測血清內(nèi)的 TGF-β1，研究發(fā)現(xiàn)一次急性運動后人體血清內(nèi) TGF-β1表達(dá)水平上升[12]。與此相似，Hering S等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，4周的運動訓(xùn)練過程中，2周內(nèi)血清內(nèi)的TGF-β1水平明顯升高，3～4周 TGF-β1水平持續(xù)下降。

骨骼肌損傷72 h后即炎癥反應(yīng)后期，此時衛(wèi)星細(xì)胞開始分化。本研究中骨骼肌損傷1周后，肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常，2周后形態(tài)基本恢復(fù)正常，骨骼肌再生修復(fù)應(yīng)進(jìn)入后期。但此時TGF-β1mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均明顯低于對照組（P＜0.05），據(jù)此推測此時衛(wèi)星細(xì)胞可能仍處于分化融合階段，損傷修復(fù)尚未完全完成，仍在進(jìn)行中，TGF-β1依然受到抑制，其具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

TGF-β在骨骼肌再生修復(fù)過程中的高表達(dá)可能會影響修復(fù)的進(jìn)行并造成纖維化[10]。研究人類馬方綜合癥（MFS）疾病小鼠動物模型實驗中，缺少原纖維蛋白Ⅰ的小鼠體內(nèi)TGF-β的活性明顯增強(qiáng)，TGF-β活性增強(qiáng)抑制了骨骼肌再生[10]。另有報道稱[6、23]，在杜氏肌營養(yǎng)不良的病人肌肉內(nèi)，TGF-β1有很高的表達(dá)，并且 TGF-β1與纖維化的形成密切相關(guān)。該作者認(rèn)為，肌營養(yǎng)不良發(fā)生后，肌肉開始變性，緊接著是肌肉逐漸壞死，炎癥反應(yīng)發(fā)生在壞死的區(qū)域，局部病灶釋放 TGF-β1，并通過激活細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織的增生，從而引起纖維化。Amemiya K[5]和Confalonieri P[11]在皮膚炎病人的肌肉活檢標(biāo)本中，觀察到了過量的TGF-β1，他們認(rèn)為過量的 TGF-β1導(dǎo)致慢性炎癥，纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)的累積。

上述研究的共同特征是骨骼肌損傷或變性較嚴(yán)重，肌肉壞死和炎癥反應(yīng)明顯，在肌肉損傷后數(shù)天非常活躍，肌肉再生發(fā)生在損傷后7～10天內(nèi)，再生過程在2周內(nèi)達(dá)到高峰，在肌肉損傷后3～4周開始減慢，疤痕組織即纖維化的形成在損傷后2～3周內(nèi)發(fā)生[16]。

骨骼肌再生所需的時間以及修復(fù)情況與損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)，如果損傷較輕，肌纖維膜完整，則損傷在1～2周內(nèi)可以愈合，如果損傷嚴(yán)重，則損傷后3周才可以愈合，并伴有疤痕組織形成?？梢娪捎趽p傷程度的不同造成兩種不同的修復(fù)結(jié)果：完全再生和瘢痕（或部分瘢痕）修復(fù)。本實驗通過形態(tài)學(xué)觀察可見：2周組腓腸肌肌膜完整性良好，肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，未見纖維化和瘢痕組織形成，這表明本實驗骨骼肌損傷后可以實現(xiàn)完全再生，該損傷仍應(yīng)屬于“微損傷”的范疇，不同于以上研究。

4 小結(jié)

1.一次下坡跑運動能夠明顯引起運動性骨骼肌損傷，骨骼肌損傷發(fā)生2周后基本恢復(fù)正常，且未見纖維化形成。

2.骨骼肌損傷修復(fù)過程中 TGF-β1的表達(dá)整體呈下降趨勢，生物活性受到明顯抑制。

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