田德斌，袁世山

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是豬的一種重要病原，主要引起感染豬的呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙。該病最早于1987年在美國出現(xiàn)，緊接著于1989年在歐洲爆發(fā)，并從此逐漸向世界其它地區(qū)擴散[1,2]。中國1996年開始分離到PRRSV毒株，但其在豬群內(nèi)的流行和危害并未引起人們廣泛重視。直到2006年P(guān)RRSV被認(rèn)為是中國南方一些省份爆發(fā)的“豬高熱病”的主要病原后，國內(nèi)對該病原的研究才提到了前所未有的高度[3-5]。

作為動脈炎病毒科(Arteriviridae)成員之一的PRRSV為單股正鏈RNA病毒， 其基因組結(jié)構(gòu)從5'端開始依次為：5'末端非編碼區(qū)(5'-UTR)、非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(ORF1a、ORF1b)、結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(ORF2-ORF7)、3'末端非編碼區(qū)(3'-UTR)以及多聚腺苷酸尾(polyA)[6,7]。在已知的7個結(jié)構(gòu)蛋白中，GP2a (由 ORF2a編碼 )、E (ORF2b)、GP3（ORF3）和GP4（ORF4）被認(rèn)為形成多聚復(fù)合體鑲嵌于病毒粒子表面并稱之為少量囊膜蛋白（minor envelope proteins）；GP5 （ORF5）則是病毒表面的主要糖基化囊膜蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生一定中和性抗體；M（ORF6）蛋白與GP5形成二聚體對病毒顆粒包裝及其感染性起關(guān)鍵作用；N（ORF7）為核衣殼蛋白，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量非中和性抗體[8-10]。最近，研究者又發(fā)現(xiàn)一個新的結(jié)構(gòu)蛋白GP5a（ORF5a編碼），其在病毒復(fù)制過程中的功能還未知[11,12]。

PRRSV在體內(nèi)主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）, 也能感染外周血單核細(xì)胞和精子細(xì)胞[13]。在體外，目前發(fā)現(xiàn)只能感染非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104及其衍生細(xì)胞系MARC-145[14]。病毒侵入細(xì)胞是病毒復(fù)制的第一步，剖析該過程有助于深入了解病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，對于優(yōu)化疫苗設(shè)計有重要理論指導(dǎo)意義[15]。近幾年國內(nèi)外對這方面研究報道比較多，在細(xì)胞受體（cellular receptor）和病毒結(jié)合蛋白（viral attachment protein）成分歸屬上爭論不休。本文擬就對現(xiàn)有報道進行概括總結(jié)，旨在展示對PRRSV侵入細(xì)胞過程的研究動態(tài)。

1 病毒侵入細(xì)胞是受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞過程

PRRSV為囊膜病毒，具有嚴(yán)格細(xì)胞嗜性范圍。體外實驗證明PRRSV雖然不能直接進入非易感細(xì)胞（non-permissive cells）如倉鼠腎細(xì)胞系（BHK-21），但將PRRSV基因組人為導(dǎo)入BHK-21細(xì)胞中卻能產(chǎn)生完整的具有感染性的子病毒，這暗示PRRSV進入細(xì)胞需要特異受體[16]。Kreutz 等[17]利用氯喹（Chloroquine）、巴弗洛霉素（bafilomycin A1）等能阻斷細(xì)胞內(nèi)吞體（endosome）酸化、網(wǎng)格蛋白（clathrin）轉(zhuǎn)運的藥物對PRRSV進入細(xì)胞機制進行研究發(fā)現(xiàn)，在感染前或感染早期用藥物處理MARC-145或PAM細(xì)胞能明顯降低病毒的產(chǎn)量，但同樣處理細(xì)胞后再用偏酸性的培養(yǎng)基培養(yǎng)，病毒的產(chǎn)量則不會受到明顯影響，這說明PRRSV進入細(xì)胞需要細(xì)胞網(wǎng)格蛋白的參與和酸性環(huán)境。更直接的證據(jù)來自于Nauwynck等的試驗結(jié)果[18]。他們將病毒粒子用生物素-熒光素進行標(biāo)記，然后在共聚焦顯微鏡下進行細(xì)胞定位觀察發(fā)現(xiàn)病毒顆粒結(jié)合到細(xì)胞表面后由細(xì)胞網(wǎng)格蛋白形成內(nèi)吞體并逐漸向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)移動，然后脫殼釋放出核酸。如果人為降低酸性環(huán)境，則病毒粒子被局限于內(nèi)吞體中，感染性病毒核酸不能釋放出來。

以上實驗結(jié)果表明，PRRSV進入細(xì)胞不是簡單的與細(xì)胞非特異性結(jié)合，而是一個受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞過程（receptor-mediated endocytosis），病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)的脫殼和基因組釋放需要H+介導(dǎo)，這與絕大多數(shù)囊膜病毒的侵入過程相似。

2 PRRSV細(xì)胞受體研究

既然PRRSV進入細(xì)胞是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，那它的細(xì)胞受體是什么？在這個問題上人們進行了大量的研究，不同的研究得到了不同的結(jié)論。

2.1 硫酸類肝素 硫酸類肝素(heparan sulphate)是第一個被發(fā)現(xiàn)的PRRSV潛在細(xì)胞受體分子。Jusa等[19]發(fā)現(xiàn)用肝素處理過的病毒對MARC-145的感染能力顯著降低，但在病毒感染細(xì)胞30 min后再用肝素處理細(xì)胞卻不能明顯降低子病毒產(chǎn)量。同時，用降解肝素分子的肝素酶處理MARC-145細(xì)胞也能使病毒產(chǎn)量顯著下降，這就提示細(xì)胞表面一種類似肝素的物質(zhì)可能是病毒的細(xì)胞受體。Delputte等[20]受到肝素的啟發(fā)，在前人研究基礎(chǔ)上更進一步詳細(xì)地研究了肝素類分子在病毒感染中的作用。他們首先在PAM上重復(fù)出了類似的結(jié)果，然后為排除病毒粒子可能是與細(xì)胞表面類似肝素的帶負(fù)電荷分子非特異性結(jié)合的可能性，同時測試了3種不同的葡糖氨基聚糖類分子，發(fā)現(xiàn)只有硫酸類肝素具有競爭性抑制病毒感染細(xì)胞的能力，這一結(jié)果表明病毒與硫酸類肝素的結(jié)合是特異性的而不是靜電引力的結(jié)果。

但是，以上2個研究結(jié)果都發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝素加到一定量時病毒對肝素不再敏感，即始終不能達到完全阻止病毒感染的程度。這表明硫酸類肝素不是PRRSV細(xì)胞受體的唯一決定性因素，提示可能存在其它分子作為細(xì)胞受體。

2.2 唾液酸粘附素 唾液酸粘附素（sialoadhesin）是第二個被發(fā)現(xiàn)的潛在細(xì)胞受體。1998年，比利時根特大學(xué)的一個研究小組先后用外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC )和PAM免疫小鼠，獲得了2株能阻止PRRSV感染PAM的單克隆抗體41D3、41D5。用共聚焦顯微鏡結(jié)合熒光染色發(fā)現(xiàn)41D3與PAM結(jié)合的部位正是PRRSV與PAM的結(jié)合部位，且41D3能與所有感染PRRSV的組織細(xì)胞結(jié)合，提示41D3結(jié)合的可能是細(xì)胞受體分子[21,22]。后來，該研究小組對與41D3結(jié)合的蛋白進行變性凝膠電泳分離，得到一個大小為210 kDa的未知蛋白。通過質(zhì)譜和同源比對分析鑒定出該未知蛋白為豬唾液酸粘附素（pSn）。他們將pSn的基因構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒，導(dǎo)入PRRSV不能感染的豬腎細(xì)胞系(PK-15)，得到能表達pSn的rPK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PRRSV能進入rPK-15，這就有力地證明了pSn具有細(xì)胞受體的功能[23]。對pSn的進一步研究表明，細(xì)胞表面的唾液酸粘附素與病毒糖蛋白上唾液酸的結(jié)合是病毒感染的必備條件，且pSn與病毒結(jié)合的區(qū)域位于蛋白質(zhì)N端150個氨基酸中[24,25]。

至此，2個細(xì)胞表面分子肝素和唾液酸粘附素都被發(fā)現(xiàn)具有PRRSV細(xì)胞受體功能，但到底是哪一個分子起作用或起主要作用呢？該實驗室進一步研究比較了二者的功能[26]。通過一系列實驗他們得出二者的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上提出PRRSV進入細(xì)胞的模型：首先病毒與細(xì)胞表面的硫酸類肝素葡萄糖胺聚糖（heparan sulphate glycosaminoglycans）結(jié)合，這種結(jié)合不穩(wěn)定但富集了病毒，然后pSn與病毒結(jié)合并使病毒發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化，由細(xì)胞網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞進入細(xì)胞。

pSn是PRRSV細(xì)胞受體得到了很多國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)同，但卻不能很好解釋以下3個現(xiàn)象：Duan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，2株單抗41D3、41D5雖然能阻止PRRSV對PAM的感染卻不能完全阻止病毒對細(xì)胞的結(jié)合（attachment）；pSn雖然能介導(dǎo)病毒內(nèi)吞進入rPK-15，但內(nèi)吞的病毒不能脫殼，不能產(chǎn)生子病毒；作為體外能很好增殖PRRSV的MARC-145細(xì)胞本身卻并不表達pSn。

2.3 CD163 2007年Calvert等[27]報道了一個新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞分子CD163 參與病毒進入細(xì)胞過程。CD163分子是清道夫受體蛋白家族（scavenger receptor protein superfamily）中的一員，它位于細(xì)胞表面，能與眾多配體分子結(jié)合[28]。該研究小組構(gòu)建了PAM的cDNA 文庫，然后轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞篩選克隆庫。最后發(fā)現(xiàn)一個包含豬CD163分子的克隆庫能完全為BHK-21提供易感性。將CD163分子克隆后構(gòu)建真核表達質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染非易感細(xì)胞BHK-21、PK、貓腎細(xì)胞（NLFK）等發(fā)現(xiàn)均能為這些細(xì)胞提供PRRSV易感性。同時發(fā)現(xiàn)CD163分子存在于MARC-145中，用抗人CD163分子的單克隆抗體處理MARC-145細(xì)胞能有效阻止PRRSV感染[27]。以上試驗結(jié)果表明CD163分子可能是PPRSV的細(xì)胞受體。這一發(fā)現(xiàn)能很好解決如上提到的pSn所不能回答的3個問題。但是試驗中也發(fā)現(xiàn)，一些犬、人、鼠源和Vero細(xì)胞系的CD163分子也能為非易感細(xì)胞提供易感性，而這些細(xì)胞系本身卻不能繁殖PRRSV。對于這一現(xiàn)象作者解釋為病毒能進入這些細(xì)胞系但侵入的后續(xù)環(huán)節(jié)被阻斷，導(dǎo)致無感染性子病毒產(chǎn)生[27]。Patton等[29]對CD163做進一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的CD163表達水平與PRRSV復(fù)制效率呈正相關(guān)，即表達CD163水平越高的細(xì)胞產(chǎn)生子病毒的滴度越高。他們還發(fā)現(xiàn)十四烷酰佛波醋酸酯-13（TPA）、脂多糖（LPS）能下調(diào)CD163表達從而降低病毒復(fù)制水平；相反，白細(xì)胞介素10（IL-10）能上調(diào)血液單核細(xì)胞CD163的表達并調(diào)高病毒復(fù)制水平。該研究更進一步證明CD163分子在PRRSV感染細(xì)胞中的作用。CD163分子發(fā)現(xiàn)后，關(guān)于PRRSV細(xì)胞受體到底是pSn還是CD163引發(fā)了爭論。發(fā)現(xiàn)pSn的研究小組將二者做了一個比較研究[30]，他們發(fā)現(xiàn)單獨用pSn或CD163分子的抗體處理PAM都不能完全阻止病毒感染，而2種抗體一起使用則可以完全阻止。并且，僅表達pSn的重組BHK-21、PK等細(xì)胞能觀察到病毒的內(nèi)吞但內(nèi)吞的病毒不能脫殼，而僅表達CD163的重組非易感細(xì)胞系雖然能產(chǎn)生子病毒但觀察不到病毒的內(nèi)吞，同時表達二者的細(xì)胞能大大提高病毒的增殖效率。由此他們認(rèn)為：pSn是病毒結(jié)合并進入細(xì)胞的受體分子，而CD163分子則可能是參與病毒的脫殼過程，二者在病毒進入細(xì)胞過程中聯(lián)合起作用。

2.4 CD151 2007年，一個研究小組報道了CD151可能作為PRRSV細(xì)胞受體分子[31]。他們構(gòu)建了MARC-145細(xì)胞的cDNA文庫，然后用North-Western雜交的方法篩選到了一個能與PRRSV 3′UTR結(jié)合的克隆。對該克隆進行鑒定發(fā)現(xiàn)與人源、鼠源、豬源等的CD151分子最為接近，同源性達90%左右。同時他們發(fā)現(xiàn)CD151分子不但能與PRRSV 基因組的3'UTR結(jié)合，還參與病毒進入細(xì)胞過程。將表達CD151分子的克隆轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞能為BHK-21提供易感性。如果用RNA干擾方法將MARC-145細(xì)胞中的CD151基因滅活，或者用抗CD151分子的抗體封閉MARC-145細(xì)胞，則MARC-145不再感染PRRSV。這些實驗結(jié)果為CD151分子可能是細(xì)胞受體分子提供了證據(jù)。但是，實驗中發(fā)現(xiàn)用RT-PCR方法也能從豬睪丸細(xì)胞系（ST），非洲綠猴腎細(xì)胞衍生細(xì)胞系Vero和COS-7中檢測到CD151基因，而這些細(xì)胞又是PRRSV非易感細(xì)胞。同時免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)CD151分子不能與PRRSV任何結(jié)構(gòu)蛋白相互作用。這些實驗現(xiàn)象還沒能獲得很好的解釋。

2.5 波形蛋白 波形蛋白（vimentin）是一種細(xì)胞骨架蛋白，它作為可能介導(dǎo)PRRSV進入細(xì)胞的受體分子最早是在2006年被報道的[32]。Kim等[32]采用North-western的方法找到能與PRRSV核酸結(jié)合的細(xì)胞蛋白，然后用這些蛋白免疫動物并得到了一株單克隆抗體7G10。通過二維電泳分離能與7G10結(jié)合的細(xì)胞蛋白，發(fā)現(xiàn)其中的波形蛋白能結(jié)合病毒核衣殼蛋白。進一步對波形蛋白進行研究發(fā)現(xiàn)猴源波形蛋白能使BHK-21和貓腎細(xì)胞（CRFK）變?yōu)橐赘屑?xì)胞，且抗波形蛋白的單克隆抗體能阻斷PRRSV對MARC-145的感染。另外在其它病毒如人免疫缺陷病毒、非洲豬瘟病毒中，波形蛋白發(fā)現(xiàn)在病毒吸附、侵入細(xì)胞以及病毒核酸在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。

2.6 CD209 CD209能與多種病原體結(jié)合包括病毒、細(xì)菌、真菌等[33]。最近有研究發(fā)現(xiàn)將CD209的基因?qū)隑HK-21細(xì)胞后能使BHK-21細(xì)胞中產(chǎn)生的子病毒對MARC-145的感染能力增強，但CD209似乎并不直接參與病毒進入細(xì)胞過程[34]。

3 病毒結(jié)合蛋白

與細(xì)胞受體相對應(yīng)的是病毒結(jié)合蛋白。PRRSV多達8個結(jié)構(gòu)蛋白，準(zhǔn)確定位病毒結(jié)合蛋白一直是PRRSV研究的熱點問題。

3.1 M蛋白 Delputte等[20]在研究硫酸類肝素作為潛在細(xì)胞受體的報道中，同時也報道了他們對病毒結(jié)合蛋白的研究成果。他們用肝素分子與凝膠磁珠交聯(lián)后填充過濾柱，將PRRSV粒子裂解液過柱后洗脫，然后用洗脫液進行凝膠電泳和Western blot 鑒定，發(fā)現(xiàn)M和N蛋白能與肝素分子緊密結(jié)合。考慮到N蛋白是病毒粒子內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白，作為病毒結(jié)合蛋白的可能性不大，于是他們推測M蛋白以及與M形成二聚體的GP5可能是病毒結(jié)合蛋白。但是，后來的研究基本將硫酸類肝素排除在PRRSV特異細(xì)胞受體范圍之外，所以依據(jù)能否與肝素結(jié)合來判定結(jié)合蛋白不能獲得廣泛的認(rèn)可。

3.2 M/GP5復(fù)合體 2004年，發(fā)現(xiàn)唾液酸粘附素為細(xì)胞受體的研究小組報道了PRRSV表面的唾液酸是與細(xì)胞受體結(jié)合的分子[35]。因為在嚙齒動物和人類中早已證明唾液酸粘附素是巨噬細(xì)胞上特有的蛋白，能與唾液酸(sialic acid)結(jié)合。于是該研究小組研究pSn是否也具有這樣的功能與特征。在研究中他們用神經(jīng)氨酸酶或糖苷酶F處理PRRSV以破壞病毒表面的唾液酸分子，發(fā)現(xiàn)處理后的病毒對PAM的感染能力明顯下降甚至喪失，他們由此認(rèn)為病毒表面的唾液酸是與細(xì)胞受體結(jié)合的分子[35]。

唾液酸只是結(jié)合在病毒某個蛋白上的糖鏈分子，為查明這個病毒蛋白該研究小組繼續(xù)深入研究。在最近一篇報道中他們得出M/GP5復(fù)合體是病毒結(jié)合蛋白的結(jié)論[36]。Breedam等將pSn以一種可溶性融合蛋白的形式進行真核表達，得到的融合蛋白pSn-Fc被證明具有完整pSn的基本功能。用該pSn-Fc對PRRSV病毒粒子裂解液進行免疫共沉淀，再用PRRSV的各個結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體進行鑒定發(fā)現(xiàn)：GP5與M形成的二聚體(GP5/M)能與pSn-Fc緊密結(jié)合，而其它糖蛋白如GP3、GP4不能與之結(jié)合。這就表明PRRSV的GP5/M是與受體結(jié)合的配體蛋白。但是，他們得出這一結(jié)論的前提是認(rèn)定pSn是PRRSV細(xì)胞受體，而如上所述pSn是否是細(xì)胞受體還沒有得到確切的證明。另外，該試驗主要依賴于體外表達蛋白的生化試驗，而體內(nèi)是否與體外情況相同還是未知。

3.3 少量囊膜蛋白 PRRSV有4個少量囊膜蛋白(GP2a、E、GP3、GP4)。以前人們對該類蛋白關(guān)注較少，但是隨著對PRRSV認(rèn)識的深入，少量囊膜蛋白在病毒復(fù)制過程中的作用逐漸被重視。

Dobbe 等[37]的試驗工作首先提示少量囊膜蛋白可能是同為動脈炎病毒科中的馬動脈炎病毒(Equine areritis virus，EAV)的病毒結(jié)合蛋白。Dobbe 等在馬動脈炎病毒全長感染性克隆的基礎(chǔ)上，將其GP5的胞外區(qū)替換為其它動脈炎病毒的相應(yīng)區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有PRRSV和乳酸脫氫酶增高病毒 (Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV)GP5胞外區(qū)的嵌合克隆能拯救出感染性子病毒，并且拯救出的這2個嵌合病毒仍然能感染BHK-21和兔腎細(xì)胞系(RK-13)。這表明GP5胞外區(qū)不太可能是病毒結(jié)合蛋白的功能區(qū)域，否則2個嵌合病毒將不能感染BHK-21和RK-13細(xì)胞。既然胞外區(qū)不是病毒結(jié)合區(qū)，那GP5本身就不大可能是病毒的結(jié)合蛋白。另外，該研究小組用類似的方法獲得了另一個結(jié)果：M蛋白的胞外區(qū)也不能決定PRRSV細(xì)胞嗜性[38]。以上2個實驗結(jié)果基本排除了GP5/M作為病毒結(jié)合蛋白的可能性，但不能完全排除，因為：GP5或M胞外區(qū)只是一種預(yù)測，并沒有直接證據(jù)表明它們的準(zhǔn)確位置；嵌合進外源序列后雖然得到了感染性的子病毒，但同時也可能干擾了嵌合序列的高級結(jié)構(gòu)或其它未知因素使之不能行使其準(zhǔn)確功能。

后來Wissink等在研究中發(fā)現(xiàn)，缺失少量囊膜蛋白不會影響子病毒的包裝但會使子病毒喪失感染細(xì)胞的能力，這就進一步暗示少量囊膜蛋白發(fā)揮作用是在病毒侵入細(xì)胞等早期階段[9]。另外 Lee等[39]又發(fā)現(xiàn)E蛋白具有粒子通道的功能，可能參與病毒粒子脫殼過程。最近，Das等[40]以CD163分子為PRRSV細(xì)胞受體為前提，通過體外表達各結(jié)構(gòu)蛋白，然后通過免疫共沉淀方法體外研究它們與CD163分子的相互作用，發(fā)現(xiàn)GP2a與GP4能與CD163分子緊密結(jié)合。于是他們認(rèn)為GP2a/ GP4復(fù)合體很可能是病毒結(jié)合蛋白。但是，他們的研究仍然不能避免上面Breedam等發(fā)現(xiàn)GP5/M時的問題：CD163分子為受體的前提條件沒有被確證；體外生化試驗不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)真實情況。

4 結(jié)語

綜上所述，PRRSV進入細(xì)胞是一個受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過程以及需要H+促進脫殼已經(jīng)被人們接受。但主導(dǎo)這一過程的主角：細(xì)胞受體和病毒結(jié)合蛋白卻撲朔迷離和備受爭議。目前，關(guān)于細(xì)胞受體方面主要是pSn與CD163之爭，病毒結(jié)合蛋白主要是GP5/M與少量囊膜蛋白之爭，而pSn和GP5/M占優(yōu)。鑒于PRRSV在病毒學(xué)上的特殊地位和在實際生產(chǎn)上給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來的重大損失，明確病毒入侵過程將極有利于病毒學(xué)基礎(chǔ)研究和新型疫苗研發(fā)。在這方面目前主要是國外實驗室的研究成果，國內(nèi)相對還比較薄弱和滯后。我國以后應(yīng)加強這方面的研究以搶占防治PRRSV的最上游。

[1]Collins J E, Benfield D A, Christianson W T, et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332)in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs [J]. J Vet Diagn Invest, 1992, 4(2): 117-126.

[2]Wensvoort G, Terpstra C, Pol J M, et al. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus[J]. VetQ, 1991, 13(3): 121-130.

[3]Zhou L, Yang H. Porcine reproductive and respiratory syndrome in China [J]. Virus Res, 2010, 154(1-2): 31-37.

[4]Tian K, Yu X, Zhao T, et al. Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark [J]. PloS one, 2007, 2(6): e526.

[5]郭寶清, 陳章水, 劉文興. 從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離豬生殖和呼吸綜合征病毒的研究 [J]. 中國畜禽傳染病,1996, (2): 1-5.

[6]Meulenberg J J, Petersen-den Besten A, De Kluyver E P,et al. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus [J]. Virology, 1995, 206(1): 155-163.

[7]Snijder E J, Meulenberg J J. The molecular biology of arteriviruses [J]. J Gen Virol, 1998, 79 ( Pt 5): 961-979.

[8]Ostrowski M, Galeota J A, Jar A M, et al. Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain [J]. J Virol, 2002, 76(9): 4241-4250.

[9]Wissink E H, Kroese M V, van Wijk H A, et al. Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions of porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J].J Virol, 2005, 79(19): 12495-12506.

[10]Tian D, Zheng H, Zhang R, et al. Chimeric porcine reproductive and respiratory syndrome viruses reveal full function of genotype 1 envelope proteins in the backbone of genotype 2 [J]. Virology, 2011, 412: 1-8.

[11]Johnson C R, Griggs T F, Gnanandarajah J S, et al.Novel Structural Protein in Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Encoded in an Alternative Open Reading Frame 5 Present in All Arteriviruses [J]. J Gen Virol, 2011, 92(Pt 5): 1107-1116.

[12]Firth A E, Zevenhoven-Dobbe J C, Wills N M, et al.Discovery of a small arterivirus gene that overlaps the GP5 coding sequence and is important for virus production [J]. J Gen Virol, 2011, 92(Pt 5): 1097-1106.

[13]Sur J H, Doster A R, Christian J S, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus replicates in testicular germ cells, alters spermatogenesis, and induces germ cell death by apoptosis [J]. J Virol, 1997, 71(12):9170-9179.

[14]Kim H S, Kwang J, Yoon I J, et al. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS)virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line [J]. Arch Virol, 1993, 133(3-4): 477-483.

[15]Mercer J, Schelhaas M, Helenius A. Virus entry by endocytosis [J]. Annu Rev Biochem, 2010, 79: 803-833.

[16]Meulenberg J J, Bos-de Ruijter J N, van de Graaf R, et al.Infectious transcripts from cloned genome-length cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. J Virol, 1998, 72(1): 380-387.

[17]Kreutz L C, Ackermann M R. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus enters cells through a low pH-dependent endocytic pathway [J]. Virus Res, 1996,42(1-2): 137-147.

[18]Nauwynck H J, Duan X, Favoreel H W, et al. Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages via receptor-mediated endocytosis [J]. J Genl Virol, 1999, 80 ( Pt 2): 297-305.

[19]Jusa E R, Inaba Y, Kouno M, et al. Effect of heparin on infection of cells by porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J]. Am J Vet Res, 1997, 58(5): 488-491.

[20]Delputte P L, Vanderheijden N, Nauwynck H J, et al.Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages [J].J Virol, 2002, 76(9): 4312-4320.

[21]Duan X, Nauwynck H J, Favoreel H W, et al. Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrophages [J]. J Virol, 1998, 72(5): 4520-4523.

[22]Duan X, Nauwynck H J, Favoreel H, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of alveolar macrophages can be blocked by monoclonal antibodies against cell surface antigens [J]. Adv Exp Med Biol, 1998, 440: 81-88.

[23]Vanderheijden N, Delputte P L, Favoreel H W, et al.Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages [J]. J Virol, 2003, 77(15): 8207-8215.

[24]Delputte P L, Van Breedam W, Delrue I, et al. Porcine arterivirus attachment to the macrophage-specific receptor sialoadhesin is dependent on the sialic acidbinding activity of the N-terminal immunoglobulin domain of sialoadhesin [J]. J Virol, 2007, 81(17): 9546-9550.

[25]An T Q, Tian Z J, He Y X, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment is mediated by the N-terminal domain of the sialoadhesin receptor [J]. Vet Microbiol, 2010,143(2-4): 371-378.

[26]Delputte P L, Costers S, Nauwynck H J. Analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment and internalization: distinctive roles for heparan sulphate and sialoadhesin [J]. J Gen Virol, 2005,86(Pt 5): 1441-1445.

[27]Calvert J G, Slade D E, Shields S L, et al. CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses [J]. J Virol, 2007, 81(14): 7371-7379.

[28]Welch S K, Calvert J G. A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection [J]. Virus Res, 2010, 154(1-2):98-103.

[29]Patton J B, Rowland R R, Yoo D, et al. Modulation of CD163 receptor expression and replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine macrophages [J]. Virus Res, 2009, 140(1-2): 161-171.

[30]Van Gorp H, Van Breedam W, Delputte P L, et al.Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J].J Gen Virol, 2008, 89(Pt 12): 2943-2953.

[31]Shanmukhappa K, Kim J K, Kapil S. Role of CD151,A tetraspanin, in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection [J]. Virol J, 2007, 4: 62.

[32]Kim J K, Fahad A M, Shanmukhappa K, et al. Defining the cellular target(s)of porcine reproductive and respiratory syndrome virus blocking monoclonal antibody 7G10 [J]. J Virol, 2006, 80(2): 689-696.

[33]Huang Y W, Meng X J. Identification of a porcine DCSIGN-related C-type lectin, porcine CLEC4G (LSECtin),and its order of intron removal during splicing: comparative genomic analyses of the cluster of genes CD23/CLEC4G/DC-SIGN among mammalian species [J]. Dev Comp Immunol, 2009, 33(6): 747-760.

[34]Huang Y W, Dryman B A, Li W, et al. Porcine DCSIGN: molecular cloning, gene structure, tissue distribution and binding characteristics [J]. Dev Comp Immunol, 2009, 33(4): 464-480.

[35]Delputte P L, Nauwynck H J. Porcine arterivirus infection of alveolar macrophages is mediated by sialic acid on the virus [J]. J Virol, 2004, 78(15): 8094-8101.

[36]Van Breedam W, Van Gorp H, Zhang J Q, et al. The M/GP(5)glycoprotein complex of porcine reproductive and respiratory syndrome virus binds the sialoadhesin receptor in a sialic acid-dependent manner [J]. PLoS pathogens, 2010, 6(1): e1000730.

[37]Dobbe J C, van der Meer Y, Spaan W J, et al. Construction of chimeric arteriviruses reveals that the ectodomain of the major glycoprotein is not the main determinant of equine arteritis virus tropism in cell culture [J]. Virology, 2001,288(2): 283-294.

[38]Verheije M H, Welting T J, Jansen H T, et al. Chimeric arteriviruses generated by swapping of the M protein ectodomain rule out a role of this domain in viral targeting [J]. Virology, 2002, 303(2): 364-373.

[39]Lee C, Yoo D. The small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus possesses ion channel protein-like properties [J]. Virology, 2006,355(1): 30-43.

[40]Das P B, Dinh P X, Ansari I H, et al. The minor envelope glycoproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163 [J]. J Virol, 2009, 84(4): 1731-1740.