孫晨 劉麗波 李春* 劉寧 2*

1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心(國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心)，哈爾濱150028

母乳是嬰兒最理想的天然食物。它含有嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育所必需的各種營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)嬰幼兒存活、生長(zhǎng)和發(fā)育都極為重要，且其具有最高的生物利用率[1]。母乳中含有豐富的功能性低聚糖，比如唾液酸，它是一類酸性九碳單糖，一種神經(jīng)氨酸衍生物，可以促進(jìn)嬰兒大腦的發(fā)育并且提高學(xué)習(xí)能力[2]。唾液酸的主要來(lái)源是母乳，尤其是初乳中的含量最高，以寡聚糖、糖蛋白和糖脂形式存在[3-4]。人乳中唾液酸的含量在250-1500mg/L，而目前市售嬰兒配方奶粉中唾液酸含量不及200mg/L[5]。目前，美國(guó)嬰兒配方奶粉通過(guò)添加酪蛋白糖巨肽來(lái)增加唾液酸的含量，使其接近人乳中總含量[6]。雖然在總含量上接近人乳，但蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸約占70 %，游離、低聚糖結(jié)合約占30 %，這與人乳中唾液酸存在模式(蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸約占24 %，游離、低聚糖結(jié)合唾液酸占76 %）相差很大，可能會(huì)使嬰兒配方奶粉中的唾液酸在胃腸內(nèi)不能充分吸收和利用，對(duì)嬰兒大腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響[7-8]。實(shí)驗(yàn)室參照人乳中唾液酸含量和國(guó)外嬰兒配方奶粉中唾液酸添加標(biāo)準(zhǔn)，研制干法添加游離唾液酸嬰兒配方奶粉。通過(guò)添加游離唾液酸來(lái)降低嬰兒配方奶粉中蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸所占的比例，使其與人乳唾液酸存在模式更加接近，進(jìn)而在消化吸收方面與母乳相似。通過(guò)測(cè)定，當(dāng)添加量為0.14-0.28kg/t時(shí)，嬰兒奶粉中唾液酸的含量可達(dá)到生產(chǎn)要求。雖然添加量達(dá)到生產(chǎn)要求，但嬰兒配方奶粉中唾液酸在體內(nèi)消化情況我們還不了解。因此本文采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬嬰兒體內(nèi)消化環(huán)境，研究嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化性，并與母乳進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)化嬰兒配方奶粉中唾液酸的添加量，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)添加唾液酸的嬰兒配方奶粉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽酸鹽(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediaminedi hydrochloride，DMB)、Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品、胃蛋白酶1∶10000、胰蛋白酶1∶250 美國(guó)Sigma公司；甲醇與乙腈(均為色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸、三氟乙酸、三氯乙酸、冰醋酸、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、β-巰基乙醇(均為分析純)天津市光復(fù)化學(xué)精密研究所；半成品嬰兒配方奶粉 內(nèi)蒙古伊利乳業(yè)有限公司；唾液酸(Neu5Ac)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，配有可變紫外檢測(cè)器和Empower色譜工作站 美國(guó)Waters公司(帶熒光檢測(cè)器)；依利特RP-18柱(250mm×4mm，5μm)大連依利特分析儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；K-100型超聲儀 上海研永超聲儀器有限公司；DKS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海百典儀器設(shè)備有限公司；超速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HK5干粉混合機(jī) 萊州市科達(dá)化工機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 添加唾液酸嬰兒配方奶粉的制備 根據(jù)嬰兒配方奶粉的干法[9]生產(chǎn)流程（如圖1），將唾液酸與半成品嬰兒配方奶粉進(jìn)行干混，營(yíng)養(yǎng)成分和感官指標(biāo)均符合國(guó)家要求。配方1：唾液酸添加量為1.4kg/t；配方2：唾液酸添加量為2.1kg/t；配方3：唾液酸添加量為2.8kg/t.

圖1 唾液酸干法添加工藝流程圖Fig. 1 Flow chart of adding sialic acid by dry production

1.2.2 母乳樣品的采集 對(duì)中國(guó)東北地區(qū)不同泌乳階段的健康產(chǎn)婦隨機(jī)采集三組樣本，采用自動(dòng)采乳機(jī)采集人乳20mL左右，將獲得的人乳直接放入無(wú)菌塑料容器中，蓋上乳樣瓶蓋，搖勻。把乳樣分裝到2個(gè)10毫升的離心管中，按不同階段分成三組（每組三個(gè)樣品），粘貼上統(tǒng)一的標(biāo)簽，放到離心管架上，置于-20℃冰箱中，待檢。

1.2.3 體外模擬消化 體外胃的消化：配制100mL（2g）奶樣，于37℃水浴鍋中預(yù)熱10min。加入濃度為1mol/L的HCl調(diào)pH至3，加入1 g胃蛋白酶，并不斷的攪拌。水解1h，用濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)pH至7[10]。

體外腸的消化：稱取1 g胰蛋白酶，加入到上述水解液中，不斷攪拌2h。到時(shí)間后沸水浴5 min滅活。冷卻后放置室溫，待測(cè)[10]。

1.2.4 唾液酸含量的測(cè)定 利用高效液相色譜法[11-12]測(cè)定唾液酸的組分及含量。色譜條件：色譜柱：依利特 RP-18柱；流動(dòng)相：甲醇：乙腈：水＝7∶8∶85( 體積比)；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：373nm；柱溫：30℃；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：10μL.

檢測(cè)結(jié)果分為兩部分：游離和低聚糖結(jié)合唾液酸含量的測(cè)定；蛋白質(zhì)結(jié)合含量的測(cè)定。雖然唾液酸也有少部分以糖脂(神經(jīng)節(jié)苷脂)的形式存在，但是其在嬰兒配方乳粉中占總唾液酸含量的比例卻很低(＜0.5%)，所以本研究未單獨(dú)檢測(cè)(包含于游離和與低聚糖結(jié)合唾液酸中)。嬰兒配方乳粉中總唾液酸含量即為游離唾液酸、低聚糖結(jié)合唾液酸和蛋白結(jié)合唾液酸含量之和。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)處理。除非特別說(shuō)明，所有數(shù)據(jù)都是三次測(cè)試的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 母乳和嬰兒配方奶粉中唾液酸的濃度測(cè)定結(jié)果

根據(jù)不同階段采集母乳樣分為三組，每個(gè)樣品組三個(gè)樣品，母乳樣組中唾液酸的含量為三個(gè)樣品的平均值。

從表一中可以看出，母乳中游離、低聚糖結(jié)合唾液酸約占總唾液酸含量的 70%，蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸約占 30%。雖然嬰兒配方奶粉中唾液酸的含量接近母乳，但是唾液酸不同結(jié)合形式的比例與母乳有差別。這與這幾年來(lái)的研究結(jié)果相一致[13]，即母乳中唾液酸約 70%與低聚糖結(jié)合，嬰兒配方奶粉中唾液酸約 70%與蛋白質(zhì)結(jié)合。干法生產(chǎn)添加唾液酸嬰兒奶粉時(shí)，隨著游離唾液酸添加量的增大，游離、低聚糖結(jié)合唾液酸在總唾液酸含量中的比例增大，蛋白結(jié)合唾液酸含量比例減小。嬰兒配方奶粉3在含量和結(jié)合模式中比較接近母乳。

2.2 唾液酸在人工模擬胃腸液中的消化率

2.2.1 唾液酸在人工模擬胃液、腸液中的消化率 唾液酸在人工模擬胃液和人工模擬腸液中的消化率結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖2 不同樣品中唾液酸的體外胃消化率Fig.2 The vitro gastric digestibility of sialic acid in different samples

圖3 不同樣品中唾液酸的體外腸消化率Fig.3 The vitro intestinal digestibility of sialic acid in different samples

由圖2、圖3可知，嬰兒配方奶粉的唾液酸消化率與母乳有一定的差別。在人工模擬胃液、腸液的環(huán)境中，嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化率均高于母乳的消化率，主要表現(xiàn)在嬰兒配方奶粉中蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸的消化率，而游離、低聚糖結(jié)合唾液酸的消化率在母乳與嬰兒配方奶粉的對(duì)比中差異不明顯。這是由于嬰兒配方奶粉中蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸比例比較大，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、胰蛋白酶的分解，蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸消化率變化明顯。

另外，從各組樣品中唾液酸的體外胃、腸消化效果方面看，占總消化率的50%以上的唾液酸是在腸內(nèi)進(jìn)行消化分解的。因?yàn)閶雰涸跀z入食物1h之內(nèi)，胃內(nèi)pH急劇上升，最高可達(dá)6左右，遠(yuǎn)高于胃蛋白酶的最適pH，同時(shí)母乳或配方乳液在嬰兒胃內(nèi)一般只停留1～1.5h，便轉(zhuǎn)入小腸進(jìn)行進(jìn)一步的消化吸收。另一方面嬰兒腸道中分泌的胰蛋白酶活性高，數(shù)量也較多，嬰兒攝入的蛋白只有少部分在胃中得以消化分解，大部分蛋白是小腸中得以消化吸收。因此，蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸在腸液中消化比胃液中消化率大。本研究中樣品體外消化體系pH和消化時(shí)間均充分模擬嬰兒腸胃的真實(shí)環(huán)境，所以在一定程度上模擬了唾液酸在嬰兒體內(nèi)的消化情況。

2.2.2 唾液酸在人工模擬胃腸環(huán)境的總消化率

圖4 不同樣品中唾液酸的體外總消化率Fig.4 The vitro total digestibility of sialic acid in different

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，3組母乳樣品雖然是不同泌乳階段，唾液酸含量不同，但總消化率差異不明顯（p＞0.05）。嬰兒配方奶粉1，嬰兒配方奶粉2唾液酸含量達(dá)到母乳的水平，但由于蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸比例大，總消化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母乳（p＜0.05）。嬰兒配方奶粉3的總消化率雖然高于母乳的消化率，但差異并不明顯（p＞0.05），表明嬰兒配方奶粉3的唾液酸消化過(guò)程與母乳接近。干法生產(chǎn)添加唾液酸嬰兒配方奶粉時(shí)，隨著游離唾液酸添加量的增大，嬰兒配方奶粉3在唾液酸的含量和結(jié)合模式上都與母乳接近，因此，消化情況也更接近母乳。即說(shuō)明干法生產(chǎn)添加唾液酸的嬰兒配方奶粉，添加量2.8 kg/t為最優(yōu)添加量。

2.3 唾液酸在人工模擬胃腸環(huán)境中不同時(shí)點(diǎn)的消化率變化研究

在體外模擬胃腸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，分別在人工模擬胃液反應(yīng)的10、20、30、40、50、60min取樣，在人工模擬腸液的反應(yīng)的10、20、30、60、90、120min取樣測(cè)定其消化率,結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 唾液酸在人工模擬胃液中不同時(shí)點(diǎn)的消化率Fig.5 The vitro gastric digestibility of sialic acid in different time

圖6 唾液酸在人工模擬腸液中不同時(shí)點(diǎn)的消化率Fig.6 The vitro intestinal digestibility of sialic acid in different time

由圖5、圖6可知，唾液酸的變化率隨時(shí)間升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，人工模擬胃液中在30min時(shí)達(dá)到峰值，人工模擬腸液中在60min內(nèi)達(dá)到峰值。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，唾液酸在人工模擬胃液、腸液中的消化率均有所下降。雖然唾液酸在母乳和嬰兒配方奶粉中含量有所不同，但消化率整體趨勢(shì)相同。從圖中還可看到，嬰兒配方奶粉3的消化率變化最接近母乳。

3 結(jié)論

目前，市售嬰兒配方奶粉中唾液酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于母乳中唾液酸含量。添加唾液酸到嬰兒配方奶粉中，對(duì)于混合喂養(yǎng)和人工喂養(yǎng)的嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)說(shuō)，是至關(guān)重要的。由于唾液酸添加量的不同，使唾液酸在嬰兒配方奶粉中的結(jié)合模式與母乳存在差異。因此，通過(guò)模擬嬰兒體內(nèi)消化環(huán)境，對(duì)母乳和嬰兒配方奶粉中唾液酸的胃腸道消化率進(jìn)行對(duì)比分析，選擇最優(yōu)的添加量。最終得出：在母乳和嬰兒配方奶粉中，唾液酸在腸內(nèi)的消化率高于胃中的消化率，并且唾液酸在人工模擬胃液環(huán)境反應(yīng)30min，其消化率變化最大；在人工模擬腸液環(huán)境反應(yīng) 60min時(shí)，其消化率變化最大。嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化率高于母乳中唾液酸的消化率，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)合唾液酸。當(dāng)干法生產(chǎn)添加量為2.8 kg/t時(shí)，嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化率接近母乳。由此說(shuō)明此添加量既滿足生產(chǎn)的要求并且在消化吸收方面與母乳相似，因此為最優(yōu)添加量。

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