張 旻，傅志強，林矯矯

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

蛋白質(zhì)組學是研究一種細胞、組織或完整生物體在特定時空上由全部基因表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式，注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)下所表達的蛋白質(zhì)類型及其同周圍生物大分子之間的相互關系。蛋白質(zhì)是基因功能的具體實施者，因而蛋白質(zhì)組研究可以為揭示生命活動現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的依據(jù)。日本血吸蟲?。⊿chistosomiasis japonicum）是由日本血吸蟲尾蚴感染人和哺乳動物引起的、危害嚴重的人畜共患寄生蟲?。▃oonosis），是中國優(yōu)先防治的重大傳染病之一。截止2009年底，中國仍有日本血吸蟲病患者36.57萬[1]。日本血吸蟲生活史復雜，各發(fā)育階段蟲體具有獨特的生命特征，深入了解血吸蟲蛋白質(zhì)組信息有助于日本血吸蟲的生長發(fā)育、免疫逃避等機制，為開發(fā)新型抗血吸蟲病疫苗、治療藥物和診斷提究進展進行了綜述。

1 蛋白質(zhì)組學研究技術

蛋白質(zhì)組學研究主要包括蛋白質(zhì)組分分離、鑒定以及對鑒定結(jié)果的生物信息學分析等。隨著生命科學技術的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學研究技術也不斷改進，使其成為解析“生命奧秘”的主要手段之一。

1.1 蛋白質(zhì)組分分離技術

1.1.1 與電泳相關的蛋白質(zhì)組分分離技術 作為蛋白質(zhì)組分分離的經(jīng)典、核心技術之一，雙向凝膠電泳技術（two dimensional electrophoresis, 2DE）可以僅在一張膠圖上分離上千種蛋白質(zhì)，已被廣泛應用于生物科學研究的多個領域[2,3]。具體來說，雙向凝膠電泳主要包括兩相：第一相為等電聚焦（isoelectrofocusing, IEF），主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點（pI）不同而對蛋白質(zhì)混合物進行初步分離；第二相為聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），主要是根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（MW）的大小差異來實現(xiàn)對蛋白質(zhì)混合物的進一步分離[4]。其中一相的等電聚焦主要通過固相PH梯度技術[5]來實現(xiàn)的，該技術于20世紀80年代建立起來，其所用的介質(zhì)是一些弱酸或弱堿性的丙烯酰胺衍生物，形成一個穩(wěn)定、連續(xù)及線性的pH梯度，可以分離等電點（pI）只差0.001pH單位的蛋白質(zhì)，而且pH梯度穩(wěn)定，不陰極漂移，不丟失堿性蛋白，可重復性較好。

差異凝膠電泳技術（difference gel electrophoresis，DIGE）是在雙向凝膠電泳技術的基礎上于1997年形成的一種新技術，其主要步驟為：①用兩種不同的熒光染料花青（Cy2、Cy3或Cy5）標記不同的蛋白樣品；②等量混合熒光標記后的樣品；③使用相同的內(nèi)標，將混合后的樣品經(jīng)雙向凝膠電泳進行分離；④在熒光顯微鏡下，用不同的波長下來檢測熒光。若一種蛋白在兩個樣品中都有，會發(fā)出兩種熒光；若只存在于一種樣品中，則只發(fā)出一種熒光。在進行樣品蛋白質(zhì)差異表達研究的時候，與經(jīng)典的雙向凝膠電泳相比，DIGE更好地消除了實驗的偶然誤差，避免了膠與膠之間的差異，提高了實驗結(jié)果的可信度，不影響后續(xù)實驗，而且靈敏度較高，達到0.1～0.2 μg。但是，熒光染料只能標記在賴氨酸殘基上，無法標記、檢測到不含賴氨酸的蛋白質(zhì)。

毛細管電泳技術（capillary elect rop horesis，CE）是另外一種使用較為廣泛的與電泳相關的蛋白質(zhì)組分分離技術，其主要是在毛細管（內(nèi)徑5～10 μm）中，通過采用0～30 kV連續(xù)可調(diào)的直流高壓，實現(xiàn)對待測混合蛋白樣品按電泳遷移率、電荷和分子質(zhì)量大小等差異進行有效地分離。該技術具有靈敏度高、速度快、成本低、分離范圍廣、樣品需求量低等特點，可用于分離分子量范圍不適于雙向凝膠電泳技術的蛋白樣品。

1.1.2 非電泳的蛋白質(zhì)組分分離技術 高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC）產(chǎn)生于20世紀60年代末期，待分離的樣品組分是因在互不相溶的流動相（即淋洗液）及固定相（即柱填料）中分配具有差異性而實現(xiàn)分離的，即：將待分離的樣品制成溶液后，注入色譜柱，由于壓力的作用在固定相中移動，不同樣品組分會與固定相產(chǎn)生不同的相互作用，然后按照一定的順序先后流出色譜柱，最后通過對檢測器得到的峰信號的分析來判斷待檢組份所含的物質(zhì)[6]。HPLC所需壓力較高（150×105～350×105Pa），分析時速度快、效能高，且具有高靈敏度、高度自動化等特點。在高效液相色譜技術的基礎上，又產(chǎn)生了雙向高效液相色譜技術（2D-HPLC）、毛細管柱反相高效液相色譜技術（RP-HPLC），而且后者還可以與毛細管電泳（CE）或者毛細管等電聚焦（CIEF）等相互偶聯(lián)發(fā)展成多維液相色譜技術HPLC-LC和HPLC-CIEF，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)混合物進行更好、更精確地分離[7]。

1.2 蛋白質(zhì)組分鑒定技術—生物質(zhì)譜 質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）技術被廣泛應用到對蛋白質(zhì)的鑒定中，為我們分析復雜蛋白質(zhì)樣品提供了較好的平臺，而且質(zhì)譜技術近年來取得了飛速發(fā)展，其中，最為引人關注的進展是三位研究人員（Fenn，Tanaka，Wuthrich）因?qū)①|(zhì)譜及核磁共振技術應用于對生物大分子物質(zhì)的分析而獲得了2002年度的諾貝爾化學獎[8]。MS的基本原理為將待測樣品分子離子化后，由于不同物質(zhì)具有不同的離子質(zhì)荷比(m/z)，根據(jù)其差異來分離并確定這些物質(zhì)的分子量（Mr）。通常情況下，質(zhì)譜儀主要包括離子源、質(zhì)量分析器和檢測器三個部分。常用的離子化方式為電噴霧離子化（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸附離子化（MALDI），而常用的質(zhì)量分析器為四級桿（Q）、飛行時間（TOF）、離子肼（IT）以及傅里葉變換離子回旋共振（FTICR），它們既可單獨也可串聯(lián)起來使用?；|(zhì)輔助的激光解析電離—飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）方法常用于肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）技術。在PMF技術中，待測樣品中的蛋白質(zhì)需先用蛋白酶酶切，然后用MALDI-TOFMS對肽混合物質(zhì)量進行測定而得到一套肽質(zhì)量圖譜，最后將該圖譜與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)理論酶解肽質(zhì)量圖譜進行對比來對蛋白質(zhì)定性。串聯(lián)質(zhì)譜ESI-MS/MS方法常用于肽序列標簽技術（PST），在該方法中，經(jīng)一級質(zhì)譜產(chǎn)生肽段，從中選擇母離子進入二級質(zhì)譜，肽段經(jīng)惰性氣體碰撞后沿肽鏈發(fā)生斷裂并產(chǎn)生了各肽段質(zhì)量數(shù)值差值，通過該值推斷肽段序列并進行數(shù)據(jù)庫檢索從而獲得肽段的氨基酸序列。隨著技術的不斷發(fā)展，質(zhì)譜技術不僅可以用于蛋白質(zhì)序列的鑒定，還可用于定量蛋白質(zhì)組學分析、對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究以及用來研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。

1.3 蛋白質(zhì)組生物信息學分析 生物信息學（Bioinformatics）是一門利用計算機科學技術實現(xiàn)對生物系統(tǒng)規(guī)律進行研究的學科，其研究的主要內(nèi)容為基因組學（Genomics）和蛋白質(zhì)組學（Promomics）兩方面[9]，具體來說就是從核酸堿基序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列出發(fā)，分析這些序列中所蘊涵的生物信息。截止2006年，生物學數(shù)據(jù)庫總數(shù)已達500多個，其中包含300個左右的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[10]，這些數(shù)據(jù)庫主要用于對雙向電泳結(jié)果進行分析以及對蛋白質(zhì)序列進行分析。作為蛋白質(zhì)組學研究主要內(nèi)容之一，基于雙向電泳圖片的數(shù)據(jù)庫的主要特點為：數(shù)據(jù)具有直觀性；在蛋白質(zhì)雙向電泳圖片的基礎上整合了蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)以及功能等信息[11]。常用的該類數(shù)據(jù)庫主要有：SWISS—2DPAGE、GELBANK、ECO—2DBASE、The Rice Proteome Databas、YPD等等。作為生物信息學數(shù)據(jù)庫中最基本的數(shù)據(jù)庫，基于蛋白質(zhì)序列信息的數(shù)據(jù)庫主要包括：①主要用于蛋白質(zhì)序列測定的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，包括：未經(jīng)過信息糾正的蛋白質(zhì)信息資源數(shù)據(jù)庫PIR，具有高可信度的SWISS—PROT數(shù)據(jù)庫等等；②主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，包括：預測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的PDB，闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與進化關系的SCOP，對PDB數(shù)據(jù)庫中信息進行匯總分析的PDBsum；③主要用于蛋白質(zhì)功能鑒定的蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫，包括：GO分析，其從分子功能（MF）、生物過程（BP）以及細胞組分（CC）三個方面對蛋白質(zhì)進行分類。KEGG由基因、通路、配體化學反應、序列相似性、基因表達以及蛋白分子相互關系六個數(shù)據(jù)庫組成，幫助研究者整合基因和表達信息，使其作為一個整體網(wǎng)絡從宏觀上來進行研究。

2 日本血吸蟲蛋白質(zhì)組學研究進展

2.1 日本血吸蟲尾蚴蛋白質(zhì)組學研究 尾蚴是血吸蟲生活史中唯一一個具有感染性的階段，經(jīng)射線致弱的血吸蟲尾蚴免疫動物，可誘導動物產(chǎn)生高水平的保護性免疫力，是目前公認的誘導保護效果最高、最穩(wěn)定的抗血吸蟲病疫苗。

Yang 等[12]用雙向電泳技術對紫外線輻照致弱日本血吸蟲尾蚴及正常尾蚴的可溶性蟲體蛋白分析、比較，發(fā)現(xiàn)部分蛋白點存在顯著性差異，從中篩選出20種差異表達蛋白進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，根據(jù)功能分為五大類，即：Actin等結(jié)構(gòu)動力蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶等能量代謝相關酶類，14-3-3蛋白等信號傳導通路相關分子，HSP70 家族等相關熱休克蛋白，以及20 S 蛋白酶體等功能蛋白。從而在蛋白水平上為探討紫外線輻照致弱尾蚴誘導的免疫保護機制，發(fā)現(xiàn)新的抗日本血吸蟲病疫苗候選分子提供了新思路。

2.2 日本血吸蟲童蟲蛋白質(zhì)組學研究 血吸蟲童蟲是血吸蟲在終末宿主體內(nèi)發(fā)育的早期階段也是蟲體發(fā)育最關鍵的階段，對日本血吸蟲童蟲差異蛋白質(zhì)組學研究，不僅有助于揭示日本血吸蟲的生長發(fā)育機制，還為開拓抗血吸蟲病疫苗和潛在藥物靶標的研究提供了基礎。

趙曉宇等[13]應用雙向電泳技術和質(zhì)譜技術對日本血吸蟲16日齡童蟲和40日齡的雌、雄成蟲的可溶性蛋白進行分離、分析，獲得（26±1）個童蟲特異表達的蛋白斑點，對其所代表的16種蛋白進行生物信息學功能預測分析表明，這些蛋白可能與血吸蟲能量代謝、生物合成、信號傳導和細胞構(gòu)成等相關。孫安國等[14]收集日本血吸蟲尾蚴、童蟲（8、19日齡）、成蟲（42日齡，雌、雄蟲）和蟲卵，分別抽提可溶性及疏水性蛋白，雙向電泳技術和質(zhì)譜技術進行分離、鑒定，從中挑出22個童蟲特異表達的蛋白進行生物信息學分析表明，這些蛋白主要參與細胞代謝、應激反應、生長發(fā)育等過程。洪煬[15]收集來源于易感宿主BALB/c小鼠、不易感宿主Wistar大鼠和抗性宿主東方田鼠體內(nèi)的10日齡日本血吸蟲童蟲，應用熒光差異凝膠雙向電泳技術（2D-DIGE）和MALDI-MS/MS分析、鑒定蛋白表達情況。GO分析表明：與大鼠來源10日齡童蟲相比，小鼠來源10日齡童蟲有27個蛋白高表達、12個蛋白低表達，這些蛋白與蛋白、糖類、RNA代謝，應激反應，蛋白轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)基因表達和細胞骨架蛋白有關；與東方田鼠來源10日齡童蟲相比，小鼠來源10日齡童蟲有13個蛋白高表達、8個蛋白低表達，這些蛋白主要涉及蛋白、RNA、糖類代謝途徑，還有部分參與構(gòu)成細胞骨架。通過比較三個宿主來源10日齡童蟲的蛋白表達差異情況，有助于我們進一步了解血吸蟲的生長發(fā)育機制。

2.3 日本血吸蟲成蟲蛋白質(zhì)組學研究 血吸蟲童蟲經(jīng)雌雄合抱后發(fā)育為成蟲，寄居于終末宿主的門脈-腸系膜靜脈系統(tǒng)，雌蟲產(chǎn)卵所引起的腸、肝臟肉芽腫和纖維化是血吸蟲病的主要病變，也是疾病傳播的主要原因。因此，有關日本血吸蟲成蟲蛋白質(zhì)組學的研究也較多。

2.3.1 成蟲可溶性抗原蛋白質(zhì)組研究 為了篩選到與免疫應答相關的特異性成蟲抗原，將蛋白質(zhì)組學技術與免疫印跡技術聯(lián)合使用，從而為尋找日本血吸蟲特異性抗原提供了新思路。鄭輝等[16]用雙向電泳技術分離日本血吸蟲成蟲可溶性蛋白，以血吸蟲病患者血清為一抗，經(jīng)Western blot 免疫印跡檢測，鑒定到57個特異性日本血吸蟲成蟲抗原。Abdel-Hafeez等[17]用高效二維液相色譜分離系統(tǒng)（proteome PF 2D）分離日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原和成蟲抗原，以輻射致弱尾蚴免疫血清為一抗，經(jīng)免疫斑點法篩選獲得8個抗原候選分子，其中有兩個蛋白能與免疫血清發(fā)生強烈反應且不能被陰性血清識別。

2.3.2 成蟲性別差異蛋白質(zhì)組研究 雌雄蟲合抱是血吸蟲發(fā)育成熟的關鍵，也是雌蟲性成熟和產(chǎn)卵的前提，通過對兩者比較分析獲得差異表達蛋白，有助于揭示血吸蟲發(fā)育機理、探索控制血吸蟲雌蟲成熟產(chǎn)卵的有效方法、以及開發(fā)新的抗生殖等疫苗候選抗原分子和藥物靶標。

朱建國等[18]利用雙向電泳技術對日本血吸蟲雌雄蟲體蛋白進行了分析比較，結(jié)果表明：雄蟲只有在42 kDa、PI 5.60～5.90和28 kDa、PI 6.90～7.30兩個區(qū)域表達量高于雌蟲，在其它區(qū)域后者顯示的特異性蛋白更多。吳忠道等[19]用雙向電泳分析了日本血吸蟲雌雄蟲可溶性蛋白組分，兩者共有的多肽斑點僅有51個，多數(shù)斑點不同，認為二者差異較大。Cheng等[20]收集蟲卵、14日齡童蟲、雌蟲和雄蟲，用順序抽提方法獲得可溶性蛋白和疏水性蛋白，利用雙向電泳和質(zhì)譜對雌雄蟲合抱后差異表達蛋白進行分離和鑒定，二者特異表達的可溶性蛋白分別為（23±2）個、（41±4）個，疏水性蛋白分別為（26±3）個、（11±1）個，從雌雄蟲中各挑出12、16個特異蛋白點進行生物信息學分析表明，這些蛋白主要參與信號傳導、代謝和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等過程。袁仕善等[21]用雙向電泳技術分別對日本血吸蟲雌、雄成蟲的可溶性蛋白和疏水性蛋白進行了分離，二者特異表達的可溶性蛋白為（255±10）個、（224±12）個蛋白點，疏水蛋白為（200±11）個、（132±8）個蛋白點。經(jīng)MALDI-TOF-MS／MS對雌蟲和雄蟲特異表達的各10個蛋白點進行質(zhì)譜分析，分別鑒定到5個和1個蛋白，與日本血吸蟲的發(fā)育、生殖、營養(yǎng)和信號轉(zhuǎn)導等過程有關。Dai等[22]利用雙向電泳技術和質(zhì)譜技術，對日本血吸蟲雄蟲在合抱與未合抱狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達上的差異進行了分析，成功鑒定到二者差異表達蛋白9個，功能涉及血吸蟲的生長發(fā)育、生殖、營養(yǎng)、運動、信號傳遞等過程，為揭示雌雄合抱機制提供了理論依據(jù)。

2.3.3 成蟲排泄分泌物蛋白質(zhì)組研究 血吸蟲在終末宿主體內(nèi)完成其生活史的過程中，通過體被、腸上皮表面或者是其它器官釋放分泌物，經(jīng)免疫模擬來干擾宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[23]。鑒定血吸蟲排泄分泌物中的蛋白質(zhì)組分，有助于我們深入了解血吸蟲如何調(diào)節(jié)宿主免疫應答反應而建立慢性感染，從而發(fā)現(xiàn)抗血吸蟲感染的疫苗候選分子，藥物靶標和診斷抗原。

Liu等[24]收集日本血吸蟲成蟲排泄分泌物，經(jīng)SDS-PAGE分離后，用LC-MS/MS鑒定得到101個蛋白點，其中包括53個分泌蛋白。深入分析顯示：脂肪酸結(jié)合蛋白為其主要組成部分；熱休克蛋白HSP70、HSP90和HSP97是其最大的蛋白家族，表明這些蛋白在免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用；還有包括肌動蛋白、14-3-3、氨肽酶、烯醇化酶以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶在內(nèi)的其它分泌蛋白，其中部分蛋白已經(jīng)作為候選疫苗分子和治療靶標進行研究；抗菌蛋白CAP18、免疫球蛋白、補體等7種宿主源性蛋白也被鑒定，為表明血吸蟲的免疫逃避機制等提供了有價值的信息。余傳信等[25]用雙向電泳技術對日本血吸蟲成蟲排泄分泌物的蛋白質(zhì)組成進行分離、分析，獲得1012個蛋白點，質(zhì)譜鑒定得到139種蛋白質(zhì)，其中蟲源性蛋白為76種，包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、抑免蛋白、硫氧還蛋白過氧化物酶等蛋白，這些蛋白主要與血吸蟲生命代謝、生長發(fā)育、免疫調(diào)控相關。

2.4 日本血吸蟲體被蛋白質(zhì)組研究 體被不僅是血吸蟲直接與宿主免疫效應分子直接基礎的界面，而且不停地更新，從而導致不同發(fā)育階段蟲體體被結(jié)構(gòu)和生物學功能不斷改變，而這一切變化的分子基礎是蟲體體被蛋白的改變。所以，通過對日本血吸蟲體被蛋白的研究有可能發(fā)現(xiàn)候選疫苗分子、新藥靶標以及新診斷抗原。

Liu等[26]通過Triton X-100技術獲得了日本血吸蟲四個階段（肝型童蟲、雄蟲、雌蟲及合抱型成蟲）的體被并進行了蛋白質(zhì)組學分析，共鑒定獲得159個肝型童蟲、134個雄蟲、58個雌蟲以及156個合抱成蟲體被蛋白。值得注意的是，合抱型成蟲有85個體被蛋白并不存在于單獨提取的雄蟲或雌蟲體被中，這可能是由于體被蛋白在分離或用質(zhì)譜鑒定的過程中出現(xiàn)了差異。一些重要的血吸蟲功能分子，在該研究中得到鑒定，比如與膜相關的Sj22.6[27]、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶[28]、Sj14-3-3抗原[29]，以及一些細胞骨架蛋白和包括肌動蛋白、微管蛋白在內(nèi)的動力蛋白等等[30]。另外，還有一些分子伴侶（60、70、86、90 kDa），維持氧還穩(wěn)態(tài)的酶（如：抗氧化的硫氧還蛋白過氧化物酶和超氧化物歧化酶）以及一些Ca2+信號通路中的關鍵物質(zhì)（卡配因、肌鈣網(wǎng)蛋白、肌鈣網(wǎng)蛋白A）[31,32]，后兩類物質(zhì)很可能在藥物治療中具有重要意義。Liu等[33]收集制備日本血吸蟲尾蚴、童蟲、成蟲、蟲卵、毛蚴、成蟲體被以及卵殼樣品，用2D-LC或1-DE/1-DLC和串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，共鑒定到55個宿主源性蛋白。包括蛋白水解酶抑制劑、超氧化物歧化酶在內(nèi)的一些宿主源性蛋白，它們可能與血吸蟲抵抗宿主攻擊有關。這一結(jié)果說明血吸蟲在終末宿主體內(nèi)寄生的過程中，通過利用后者的激素、信號分子來維持自身的生長發(fā)育及逃避宿主免疫應答，有助于探討宿主抵抗血吸蟲感染的免疫機理、血吸蟲免疫逃避機制、肉芽腫的形成原因，從而加深對宿主和寄生蟲相互作用機制的理解。Mulvenna等[34]應用鏈霉親和素-生物素的方法提取成蟲體被蛋白，酶切后經(jīng)游離膠分餾器（OFFGEL）分離后，進一步用LC-MS/MS鑒定得到54個體被蛋白，包括一些葡糖糖轉(zhuǎn)運蛋白，氨基通透酶和亮氨酸氨肽酶、Sm29同源物各1個，四次跨膜蛋白家族成員，以及一系列的轉(zhuǎn)運蛋白、熱休克蛋白和新發(fā)現(xiàn)的具有免疫活性的蛋白質(zhì)。此外，通過使用電子顯微鏡對標記的體被蛋白進行觀察，還發(fā)現(xiàn)部分膜蛋白經(jīng)內(nèi)化而進入連接體被細胞體和體被基質(zhì)的胞質(zhì)橋中，這不僅在一定程度上解釋了日本血吸蟲是如何躲避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的，而且為篩選血吸蟲新藥物靶標以及候選疫苗分子提供了新思路。

2.5 與藥物和診斷相關的蛋白質(zhì)組研究 雖然以吡喹酮為主的化學療法是治療血吸蟲病和控制傳播的重要手段之一，但是隨著大規(guī)模地反復化療會引起重復感染和抗藥性等問題[35]。因此，有必要闡明藥物作用機制，為新藥的開發(fā)提供依據(jù)。張玲等[36]用二維-納噴霧-液相色譜聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜（2D-nano-LC-MS／MS）技術鑒定、比較吡喹酮處理前后日本血吸蟲成蟲蛋白質(zhì)組，共鑒定到16個藥物處理前后差異表達的蛋白質(zhì)，主要涉及細胞骨架、細胞應激反應、細胞間信號傳導等功能，提示這些蛋白與吡喹酮的作用機制有關。曲國立等[37]收集日本血吸蟲湖南株、江西株和江蘇株的成蟲，分別制備三者雌、雄蟲的可溶性蛋白，用雙向電泳技術分離，兩兩比較后獲得14個雄蟲差異蛋白點和18個雌蟲差異蛋白點，從中分別選擇7個、3個蛋白點進行MALDI-TOF-MS鑒定分析，結(jié)果表明這些不同地理株差異表達的蛋白可能與蛋白翻譯后修飾、蛋白代謝、信號轉(zhuǎn)導、細胞調(diào)控及能量代謝等過程相關，從而為了解不同地理株對吡喹酮敏感性的機制提供了基礎。

目前，缺乏敏感、特異的血吸蟲病診斷技術，尤其是對早期的血吸蟲感染的檢測技術。Zhong等[38]用二維電泳技術分離日本血吸蟲成蟲可溶性抗原，以血吸蟲兔陽性血清為一抗進行免疫印跡分析，獲得10個蛋白點進行LC/MS-MS分離、鑒定，研制了其中兩個抗原SjLAP和SjFABP的重組蛋白，并以它們作為診斷抗原，應用ELISA方法來診斷人血吸蟲病。結(jié)果顯示：二者檢測的特異性高達96.7%；二者檢測急性血吸蟲病感染的敏感性分別為98.1%、100%，檢測慢性血吸蟲病感染的敏感性為87.8%、84.7%。經(jīng)吡喹酮治療后，SjLAP和SjFABP的抗體滴度也顯著性降低。因而，SjLAP和SjFABP不僅可以用于對血吸蟲病的檢測，還能評估藥物治療效果。Huang等[39]用日本血吸蟲尾蚴感染新西蘭大白兔，1周后收集陽性血清，經(jīng)弱陽離子磁球處理，進一步用MALDI-TOF-MS分析。與陰性血清相比，陽性血清鑒定到7個特異性峰，將此特異性蛋白質(zhì)組模型用于檢測1～4周感染兔血清，有效率分別為30%，55%，75% 和80%，結(jié)果表明：在兔子實驗動物模型中，MALDI-TOF-MS與磁珠分離聯(lián)合使用，可以準確、快速地檢測早期血吸蟲感染。

3 結(jié)語

蛋白質(zhì)組學一種高通量生物技術工具，已經(jīng)被廣泛運用到多個研究領域。目前，對日本血吸蟲蛋白質(zhì)組學研究還主要是對不同期別蟲體蛋白質(zhì)組、不同性別蟲體差異蛋白質(zhì)組、排泄分泌物以及部分組織和器官蛋白質(zhì)組、與藥物和診斷相關的蛋白質(zhì)組的組分的分離，對少數(shù)組分進行鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些重要蛋白質(zhì)分子，但在相關蛋白組分的注釋等方面有待加強。日本血吸蟲基因組全序列草圖已于2009年6月繪制完成[40]，這為日本血吸蟲后基因組學的研究尤其是蛋白質(zhì)組學提供了大量有價值的序列信息。隨著蛋白質(zhì)組學技術的不斷改進，新方法的不斷出現(xiàn)，日本血吸蟲蛋白質(zhì)組學的研究也將不斷深入，為研制開發(fā)新型疫苗、藥物和診斷制劑提供重要的理論基礎。

[1]郝陽, 鄭浩, 朱蓉, 等. 2009年全國血吸蟲病疫情通報[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2010, 22(6): 521-527.

[2]Molloy M P, Phadke N D, Maddock J R, et al. Twodimensional electrophoresis and peptide mass fingerprinting of bacterial outer membrane proteins[J]. Electrophoresis,2001, 22(9): l686-1696.

[3]Taforeau M,Verdus M C,Charlionet R, et al. Twodimensional electrophoresis investigation of short term response of flex seedlings to a cold shock[J]. Electrophoresis,2002, 23(15): 2534-2540.

[4]李明珠, 張部昌, 黃留玉. 蛋白質(zhì)組學中的分離檢測技術[J]. 生物技術通訊, 2005,16(1): 93-95.

[5]Cordwell S J, Basseal D J, Bjellqvist B, et al. Characterisation of basic protein from Spiroplasm rnelliferum using novel immobilised pH gradients[J]. Electrophoresis, 1997, l8(8):1393-1398.

[6]鐘延霞. 高效液相色譜在藥物分析與分離中的應用[D].石家莊: 河北師范大學, 2007.

[7]高明霞, 張祥民. 多維液相色譜技術的進展[J]. 中國科學B輯:化學, 2009, 39(8): 670-677.

[8]Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics[J]. Nature, 2003, 422: 198-207.

[9]Wilkim M R, Pasquall C, Appel R D, et al. From proteins to proteome: large scale protein identification by towdimensiorlal electrophresis and amino acid an1ysis[J].Biotechnology, 1996, 14(1): 61-65.

[10]黃嘯. 生物信息學在蛋白質(zhì)組學上的應用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2006, 34(23): 6142-6144.

[11]馬袁君, 程震龍, 孫野青. 生物信息學及其在蛋白質(zhì)組學中的應用[J]. 生物信息學, 2008, 6(1): 38-39.

[12]Yang L L, Lv Z Y, Hu S M, et al. Schistosomajaponicum:proteomies analysis of differentially expressed proteins fromultraviolet-attenuated cercariae compared to normal cercariae [J]. Parasitol Res, 2009, 105(1): 237-248.

[13]趙曉宇, 姚利曉, 孫安國, 等. 日本血吸蟲童蟲部分差異表達蛋白的質(zhì)譜分析[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2007, 37(1):1-6.

[14]孫安國. 日本血吸蟲期別、性別差異表達蛋白質(zhì)組研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2006.

[15]洪煬. 日本血吸蟲童蟲在不同敏感性宿主體內(nèi)差異表達蛋白的研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2011.

[16]鄭輝, 吳赟, 余軼婧, 等. 雙向電泳聯(lián)合免疫印跡技術分析日本血吸蟲成蟲可溶性抗原[J]. 臨床輸血與檢驗,2009, 11(2): 107-112.

[17]Abdel-Hafeez E H, Kikuchi M, Watanabe K, et al.Proteome approach for identification of schistosomiasis japonica vaccine candidate antigen [J]. Parasitol Intl,2009, 58: 36-44.

[18]朱建國, 林矯矯, 苑純秀, 等. 日本血吸蟲成蟲蛋白質(zhì)的性別差異性研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2001,19(2): 107-109.

[19]吳忠道, 徐勁, 孟瑋, 等. 日本血吸蟲雌雄成蟲可溶性蛋白組分的雙向電泳分析[J]. 熱帶醫(yī)學雜志, 2001,I(2): 120-123.

[20]Cheng G F, Lin J J, Feng X G, et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins between the male and female worm of Schistosoma japonicum after pairing [J].Proteomics, 2005, 5(2): 511-521.

[21]袁仕善, 邢秀梅, 劉建軍, 等. 日本血吸蟲成蟲性別差異蛋白的篩選及鑒定[J].中華預防醫(yī)學雜志, 2009,43(8): 695-699.

[22]戴橄, 汪世平, 余俊龍, 等. 日本血吸蟲單性感染雄蟲和雙性感染雄蟲差異表達蛋白的篩選與鑒定[J]. 生物化學與生物物理進展, 2007, 34(3): 283-291.

[23]Jenkins S J, Hewitson J P, Jenkins G R, et al. Modulation of the host’s immune response by schistosome larvae[J].Parasite Immunol, 2005, 27: 385-393.

[24]Liu F, Cui S J, Hu w, et a1. Excretory/ Secretory Proteome of the Adult Developmental Stage of Human Blood Fluke, Schistosoma japonicum[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2009, 8(6): 1236-1251.

[25]余傳信, 趙飛, 殷旭仁, 等. 日本血吸蟲成蟲嘔吐和排泄分泌物的蛋白質(zhì)組學分析[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2010, 22(4): 304-309.

[26]Liu F, Lu J, Hu W, et al. New perspectives on host-parasite interplay by comparative transcriptomic and proteomic analyses of Schistosomajaponicum[J]. PLoS Pathog,2006, 2(4), e29.

[27]Li Y, Auliff A, Jones M K, et al. Immunogenicity and immunolocalization of the 22.6 kDa antigen of Schistosoma japonicum[J]. Parasite Immunol, 2000, 22:415-424.

[28]Liu J L, Fontaine J, Capron A, et al. Ultrastructural localization of Sm28 GST protective antigen in Schistosoma mansoni adult worms[J]. Parasitology, 1996,113(Pt 4): 377-391.

[29]Schechtman D, Winnen R, Tarrab-Hazdai R, et al.Expression and immunolocalization of the 14-3-3 protein of Schistosoma mansoni[J]. Parasitology, 2001,123(Pt 6): 573-582.

[30]Hall N, Karras M, Raine J D, et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic transcriptomic and proteomic analyses[J]. Science, 2005,307(5706): 82-86.

[31]Kohn A B, Anderson P A, Roberts-Misterly J M, et al.Schistosome calcium channel beta subunits unusual modulatory effects and potential role in the action of the antischistosomal drug praziquantel[J]. J Biol Chem, 2001,276(40): 36873-36876.

[32]Bonn D. Schistosomiasis: A new target for calcium channel blockers[J]. Lancet Infect Dis, 2004, 4(4):190.

[33]Liu F, Hu W, Cui S J, et a1. Insight into the host-parasite interplay by proteomic study of host proteins copurified with the humanparasite, Schistosoma japonicum[J]. Proteomics,2007, 7(3): 450- 462.

[34]Jason Mulvenna, Luke Moertel, Malcolm K, et al. Exposed proteins of the Schistosoma japonicum tegument[J]. Int J Parasitol, 2010, 40(5): 543-554.

[35]Ismail M, Botros S, Metwally A, et al. Resistance to praziquantel: direct evidence from Schistosoma mansoni isolated from Egyptian villagers[J]. Am J Trop Med Hyg,1999, 60(6): 932-935.

[36]張玲, 徐斌, 周曉農(nóng). 吡喹酮處理日本血吸蟲成蟲蛋白質(zhì)組學分析[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2008,26(4): 258-263.

[37]曲國立, 陶永輝, 李洪軍, 等. 中國大陸日本血吸蟲地理株間成蟲蛋白質(zhì)組分的差異[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2010, 22(4): 315-319.

[38]Zhong R Z, Zhou H B, Li X Y, et al. Serological proteome-oriented screening and application of antigens for the diagnosis of Schistosomiasis japonica[J]. Acta Tropica, 2010, 116:1-8.

[39]Huang Y Z, Yang G J, Kurian D, et al. Proteomic patterns as biomarkers for the early detection of schistosomiasis japonica in a rabbit model[J]. Int J Mass Spectron, 2011,299: 191-195.

[40]The Schistosoma japonicum Genome Sequencing and Functional Analysis Consortium. The Schistosoma japonicum genome reveals features of host-parasite interplay[J]. Nature, 2009, 460(7253): 345-351.