梁春柳，姚朗，張?zhí)鞂?/p>

(1.南方醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，廣東廣州510515;2.第二軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海200433)

擴展的簡單串聯(lián)重復(fù)位點誘發(fā)突變在遺傳毒理學(xué)的應(yīng)用進展

梁春柳1，姚朗1，張?zhí)鞂?

(1.南方醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，廣東廣州510515;2.第二軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，上海200433)

擴展的簡單串聯(lián)重復(fù)(ESTRs)序列是基因組DNA上高不穩(wěn)定的一類重復(fù)序列。由于其自發(fā)突變和誘發(fā)突變率高，因而在生殖細胞誘發(fā)突變中的研究中得到廣泛的應(yīng)用。隨著研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)有3類重復(fù)序列——小衛(wèi)星、微衛(wèi)星和ESTRs，主要通過系譜法和單分子PCR法來研究這些重復(fù)序列的變化。但迄今為止，這些重復(fù)序列的突變機制還不明確。本文主要綜述了目前國內(nèi)外對這3種重復(fù)序列的異同、ESTRs突變研究方法的優(yōu)缺點以及突變機制。

串聯(lián)重復(fù)序列;等位基因;突變;系譜;聚合酶鏈反應(yīng)

對小鼠生殖細胞誘發(fā)突變的分析是目前評價人類暴露于化學(xué)誘變劑和射線所產(chǎn)生的遺傳危險的主要依據(jù)。而大部分小鼠誘發(fā)突變資料是通過特異位點實驗(russell 7位點實驗)或顯性致死實驗獲得［1-2］。雖然這兩個實驗都可為化合物誘發(fā)突變及其精子生成階段特異性提供重要信息，但是有兩個缺點:第一，檢測位點的自發(fā)突變率很低，因而需要大量的F1代樣本才能獲得有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果。第二，為了在F1代檢測到有統(tǒng)計學(xué)意義的突變，F(xiàn)0代必須暴露于高濃度的受試物中。故當小鼠暴露于低濃度甚至是中濃度化學(xué)誘變劑時，這兩種方法檢測生殖細胞誘導(dǎo)突變的敏感性不高，而這一劑量范圍又是遺傳毒理學(xué)所關(guān)注的。因此，需發(fā)展更敏感、更有效的方法來評價化學(xué)誘變劑的生殖效應(yīng)。

擴展的簡單串聯(lián)重復(fù)(expanded simple tandem repeats，ESTRs)位點是基因組DNA上極不穩(wěn)定的等位基因位點。它是由短核心序列單位組成的長重復(fù)序列，其自發(fā)突變和誘發(fā)突變的發(fā)生率都很高。1993年Dubrova等［3］首次提出用ESTRs分析生殖細胞誘導(dǎo)突變，用ESTRs作為生物標志來研究生殖細胞誘發(fā)突變所需的樣本量比用傳統(tǒng)方法的少得多，并且可研究低劑量暴露條件下甚至是環(huán)境相應(yīng)暴露水平下生殖細胞的誘發(fā)突變。目前，ESTRs已成為研究生殖細胞誘發(fā)突變和其后代遺傳危險度的有效工具［4-5］。本文擬扼要綜述基因組ESTRs位點誘發(fā)突變的研究現(xiàn)狀。

1 ESTRs與小衛(wèi)星和微衛(wèi)星的異同

在過去十幾年中，人們通常用人類小衛(wèi)星位點和小鼠ESTRs位點來研究生殖細胞誘發(fā)突變［6］，少數(shù)研究中還用到微衛(wèi)星位點。這三類重復(fù)序列的主要區(qū)別在于其長度和核心重復(fù)序列單位的大?。?］。人類小衛(wèi)星大多是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的，并主要存在于非編碼區(qū)，其核心重復(fù)序列長度為10～60 bp，可擴增到0.5～1 kb大小，且其突變幾乎只發(fā)生于生殖細胞中。而ESTRs目前只在小鼠DNA上發(fā)現(xiàn)，由4～6 bp的核心重復(fù)序列構(gòu)成，可擴展到長0.5～16 kb，且在生殖細胞和體細胞中其都可發(fā)生突變。而微衛(wèi)星則較短，它的核心重復(fù)序列長度為1～6 bp，最多可擴展到600 bp。這三類位點的相同點是:在不同的序列中，其核心重復(fù)單位是不變的，但重復(fù)單位的數(shù)量卻是多變的。等位基因重復(fù)單位的種類及其數(shù)量的差異，是造成這些重復(fù)序列多態(tài)性的主要原因。這些位點大多都不穩(wěn)定，自發(fā)突變率較高，并且可產(chǎn)生誘發(fā)突變。因此，用這些位點來研究生殖細胞誘發(fā)突變時所需的樣本量比傳統(tǒng)方法的少得多，因而備受關(guān)注［8-18］。

2 ESTRs突變的研究方法

2.1 系譜分析法

系譜分析法就是通過比較子代指紋圖譜條帶與其父本和母本條帶的偏移情況，來判斷是否發(fā)生突變的［3］。但若同一窩子代中都出現(xiàn)相同條帶的突變或出現(xiàn)新條帶，則不能判定為突變。該方法的實驗步驟及實驗數(shù)據(jù)處理相對簡單，但為了獲得有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果，需要大量的子代樣本，實驗周期比較長，工作量也較大，費時費力，而且還可能涉及倫理學(xué)問題。

2.2 單分子PCR法

近幾年來，人們發(fā)展了單分子PCR的方法來研究ESTRs誘發(fā)突變。單分子PCR是一種以極少量DNA分子(1，5或10個分子)為模板而進行的擴增的聚合酶鏈反應(yīng)。在高保真度DNA聚合酶作用下，它能擴增出高度一致的DNA分子。與常規(guī)PCR相比，它有以下優(yōu)點［19-21］:①模板數(shù)極少，通常為1，5或10個DNA分子;②反應(yīng)體系微量化，大多為5～10 μl;③可構(gòu)建出大小可控的文庫;④應(yīng)用前景廣闊，選用的聚合酶不同，其用途也不同。

因為該方法所需的樣本量較少，實驗中不必考慮倫理學(xué)問題。更重要的是，該方法既可研究體內(nèi)ESTRs誘發(fā)突變，也可通過體外實驗的方法來研究，并可查出生殖細胞和體細胞組織的從頭合成突變。這為ESTRs誘發(fā)突變機制的研究提供了便利的條件。但用該方法研究ESTRs突變時，也存在一些缺陷。單分子PCR反應(yīng)體系微量化，引物之間易形成二聚體，從而降低反應(yīng)體系的擴增效率。而擴增產(chǎn)物需要進行兩次Southern雜交才能判定是否發(fā)生了突變。實驗操作過程比較繁瑣，且需要分析親本模板數(shù)等更多的數(shù)據(jù)信息。

3 ESTRs突變的界定標準

判斷ESTRs突變的標準不同對實驗結(jié)果影響較大。目前大多采用DNA系譜法直接比較F1代和其親本ESTRs條帶的電泳移動率。在精確要求的情況下，只要呈現(xiàn)＞200 bp的移動率就可鑒定為突變［8］，其他還有將＞30 bp［9］，甚至＞15 bp界定為突變的［10］。由于ESTRs突變主要是指核心序列單位的插入或缺失，用高精度的評分標準則低估實際的突變率，從而可能丟失部分誘導(dǎo)突變效應(yīng)。嚴格執(zhí)行突變評分標準就會使整體的突變率急劇降低，但不會影響誘導(dǎo)突變的大體趨勢。ESTRs突變的界定標準有用遷移率≥1 mm或≥2 mm的。但＞2 mm的條帶改變不常見。提高遷移率的評分標準，將會損失部分突變信息。由于ESTRs誘發(fā)突變實驗可能受實驗所用鼠系、劑量范圍和鑒定突變標準的影響。所以，除非是在同一實驗室進行，或是用同一實驗方案，否則各實驗中得到的ESTRs突變率不能直接進行比較。但能對不同實驗中得到的ESTRs誘發(fā)突變率進行相對比較分析。

4 ESTRs突變機制

對ESTRs突變研究發(fā)現(xiàn)，在作用靶點上其突變率并不升高，而在靶點外卻呈現(xiàn)升高，且此突變可以傳遞到下幾代，故認為ESTRs誘發(fā)突變是由非靶點的間接突變機制造成的。Sadamoto等［11］發(fā)現(xiàn)精子受輻射后其F1代來源于母本的等位基因的突變率輕微升高。這一現(xiàn)象進一步驗證了ESTRs位點誘發(fā)突變是由間接的機制引起的。但其突變的確切分子機制尚未清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，ESTRs突變和微衛(wèi)星突變相似，主要通過有絲分裂和(或)減數(shù)分裂復(fù)制滑移而產(chǎn)生突變。而人類小衛(wèi)星突變則主要基于重組的機制產(chǎn)生突變的［6，12］。

5 ESTRs位點誘發(fā)突變的研究進展

5.1 ESTRs的鼠系差異

ESTRs位點序列在不同小鼠品系中存在差異。例如，Barber等［14］發(fā)現(xiàn)不同鼠系ESTRs位點的自發(fā)突變率和射線誘導(dǎo)的跨代不穩(wěn)定性存在差異，并發(fā)現(xiàn)以下3個鼠系的突變率為BALB/c＞CBA/H＞C57BL/6，同時還發(fā)現(xiàn)ESTRs位點突變率的差異可能與細胞周期素依賴性激酶抑制劑2a(Cdkn2a)基因和DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位(Prkdc)基因的功能性差異有關(guān)。而ESTRs的鼠系差異性不僅表現(xiàn)為其突變率的高低，也出現(xiàn)等位基因長度的不同。如，scid/C.B-17品系小鼠親本的兩個等位基因——Ms6-hm和Hm-2的平均長度為4 kb和7 kb;C57BL/6品系小鼠的則分別為7 kb和10 kb;PARP-/-/PARP+/+小鼠的分別為6.5 kb和5 kb;而CBA/J小鼠的則分別為3 kb和8 kb［15］。這些特點更說明不同實驗條件下的結(jié)果不能直接進行比較。

5.2 ESTRs階段特異性

早期研究發(fā)現(xiàn)，射線可誘導(dǎo)生殖細胞ESTRs突變率增高，但研究精子形成過程中誘發(fā)突變敏感期時卻得到相互矛盾的結(jié)果。Yauk等［10］用1Gy X線單次急性照射C57BL/6×CBA/H雜交的F1代雄性小鼠，10周后處死，取脾、腦和附睪，用單分子PCR法分析ESTRs突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子ESTRs突變率顯著升高。后來有研究發(fā)現(xiàn)精原細胞和精原干細胞受輻射后ESTRs誘發(fā)突變率顯著增高［13］。因此，目前普遍認為有絲分裂前的雄性生殖細胞對電離輻射誘導(dǎo)ESTRs突變敏感。此外，在有絲分裂前受輻射的精子中可直接觀察到ESTRs突變。這一時間與特定位點實驗不同，后者的敏感期是在減數(shù)分裂的晚期精母細胞和減數(shù)分裂后期的精子細胞期。對于ESTRs誘發(fā)突變的時期特異性，Niwa等［15］對其可能的影響因素進行討論，認為精子細胞暴露時間的輕微差異是導(dǎo)致時期特異性不同的原因。

在化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)小鼠生殖細胞ESTRs突變的研究中也發(fā)現(xiàn)時期特異性。Vilari?o-Güell等［17］將雄性小鼠暴露于乙基亞硝基脲和異丙基甲磺酸和依托泊苷后，用系譜法研究發(fā)現(xiàn)乙基亞硝基脲和異丙基甲磺酸可使小鼠減數(shù)分裂前的精原細胞ESTRs突變率增高2.2～3.0倍，但減數(shù)分裂后精子細胞的ESTRs突變率則不發(fā)生變化。這一研究首次系統(tǒng)地說明化學(xué)誘變劑實際上是可以誘導(dǎo)ESTRs突變的，且減數(shù)分裂和減數(shù)分裂前的二倍體雄性生殖細胞對誘發(fā)突變敏感。

Yauk等［16］在小鼠暴露于空氣顆粒污染物后，用單分子PCR法研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露于空氣顆粒污染物10周，并脫離接觸6周后，其生殖細胞ESTRs突變率升高1.6倍，而接觸3周及10周的小鼠生殖細胞ESTRs突變率則不變。

5.3 ESTRs位點誘發(fā)突變的劑量反應(yīng)關(guān)系

在射線誘導(dǎo)ESTRs突變的研究中，Niwa等［9］用系譜法研究發(fā)現(xiàn)父本減數(shù)分裂后的精子細胞受0.35，0.7和1.02 Gy的中子輻射后，其ESTRs位點Ms6-hm的突變率分別升高2.1，3.1和2.9倍。在化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)生殖細胞ESTRs位點突變的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。Vilari?o-Güell等［17］對暴露于乙基亞硝基脲和異丙基甲磺酸等化學(xué)物質(zhì)的雄性小鼠進行研究，暴露劑量為12.5～25 g·L-1時減數(shù)分裂前生殖細胞的ESTRs誘發(fā)突變率呈直線上升。但暴露劑量超過此范圍后，ESTRs誘發(fā)突變率就會出現(xiàn)平臺期。隨后Glen等［18］用單分子PCR法研究幾種抗癌藥物誘導(dǎo)小鼠ESTRs突變時發(fā)現(xiàn)，小鼠接觸絲裂霉素C 2.5和5 mg·kg-1，其ESTRs位點突變率增加，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系;接觸美巴那肼(甲芐肼，mebanazine)50 mg·kg-1，ESTRs位點突變率增加，但當劑量為100 mg·kg-1時，突變率卻未增加。

總之，在低劑量范圍內(nèi)，ESTRs誘發(fā)突變率隨著作用劑量的升高而升高，但達到一定濃度后，其突變率會出現(xiàn)飽和。但由于ESTRs誘發(fā)突變是非靶點的，其劑量-反應(yīng)之間不存在機械性的聯(lián)系。從而使得解釋ESTRs誘發(fā)突變較為困難，尤其是在獲得預(yù)期外的結(jié)果之后更難以解釋。

6 展望

理論上用ESTRs位點來分析誘導(dǎo)突變，其敏感度很高，利于人們進行低劑量暴露誘導(dǎo)遺傳突變的研究。然而，由于人們對生殖細胞ESTRs誘發(fā)突變的細胞和分子機制以及ESTRs突變率和非中性位點之間的關(guān)系的認識很少，阻礙了對ESTRs突變進行深入地研究。另外，目前僅發(fā)現(xiàn)小鼠ESTRs的2個位點，并且在ESTRs誘發(fā)突變的劑量反應(yīng)和時期特異性的研究中出現(xiàn)一些矛盾的結(jié)果。因此，要想使ESTRs位點在毒理學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用，則需要進一步弄清其誘導(dǎo)突變的機制，并且應(yīng)該繼續(xù)在可控的條件下對ESTRs誘發(fā)突變的劑量反應(yīng)和時期特異性進行深入研究，以驗證結(jié)果的正確性。

［1］Witt KL，Bishop JB.Mutagenicity of anticancer drugs in mammalian germ cells［J］.Mutat Res，1996，355(1-2):209-234.

［2］Shelby MD.Selecting chemicals and assays for assessing mammalian germ cell mutagenicity［J］.Mutat Res，1996，352(1-2):159-167.

［3］Dubrova YE，Jeffreys AJ，Malashenko AM.Mouse minisatellite mutations induced by ionizing radiation［J］.Nat Genet，1993，5(1):92-94.

［4］Singer TM，Lambert IB，Williams A，Douglas GR，Yauk CL.Detection of induced male germline mutation:correlations and comparisons between traditional germline mutation assays，transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays［J］.Mutat Res，2006，598(1-2):164-193.

［5］Verhofstad N，Linschooten JO，van Benthem J，Dubrova YE，van Steeg H，van Schooten FJ，et al.New methods for assessing male germ line mutations in humans and genetic risks in their offspring［J］.Mutagenesis，2008，23(4):241-247.

［6］Yauk CL.Advances in the application of germline tandem repeat instability for in situ monitoring［J］.Mutat Res，2004，566(2):169-182.

［7］Ryo H，Nakajima H，Nomura T.Germ-line mutations at a mouse ESTR(Pc-3)locus and human microsatellite loci［J］.J Radiat Res(Tokyo)，2006，47(Suppl B):B31-B37.

［8］Hedenskog M，Sj?gren M，Cederberg H，Rannug U.Induction of germline-length mutations at the minisatellites PC-1 and PC-2 in male mice exposed to polychlorinated biphenyls and diesel exhaust emissions［J］.Environ Mol Mutagen，1997，30(3):254-259.

［9］Niwa O，F(xiàn)an YJ，Numoto M，Kamiya K，Kominami R.Induction of a germline mutation at a hypervariable mouse minisatellite locus by 252Cf radiation［J］.J Radiat Res(Tokyo)，1996，37(3):217-224.

［10］Yauk CL，Dubrova YE，Grant GR，Jeffreys AJ.A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus［J］.Mutat Res，2002，500(1-2):147-156.

［11］Sadamoto S，Suzuki S，Kamiya K，Kominami R，Dohi K，Niwa O.Radiation induction of germline mutation at a hypervariable mouse minisatellite locus［J］.Int J Radiat Biol，1994，65(5):549-557.

［12］Barber R，Plumb M，Smith AG，Cesar CE，Boulton E，Jeffreys AJ，et al.No correlation between germline mutation at repeat DNA and meiotic crossover in male mice exposed to X-rays or cisplatin［J］.Mutat Res，2000，457(1-2):79-91.

［13］Barber R，Plumb MA，Boulton E，Roux I，Dubrova YE.Elevated mutation rates in the germ line of first-and second-generation offspring of irradiated male mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(10):6877-6882.

［14］Barber RC，Miccoli L，van Buul PP，Burr KL，van Duyn-Goedhart A，Angulo JF，et al.Germline mutation rates at tandem repeat loci in DNA-repair deficient mice［J］.Mutat Res，2004，554(1-2):287-295.

［15］Niwa O.Induced genomic instability in irradiated germ cells and in the offspring;reconciling discrepancies among the human and animal studies［J］.Oncogene，2003，22(45):7078-7086.

［16］Yauk C，Polyzos A，Rowan-Carroll A，Somers CM，Godschalk RW，Van Schooten FJ，et al.Germ-line mutations，DNA damage，and global hypermethylation in mice exposed to particulate air pollution in an urban/industrial location［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(2):605-610.

［17］Vilari?o-Güell C，Smith AG，Dubrova YE.Germline mutation induction at mouse repeat DNA loci by chemical mutagens［J］.Mutat Res，2003，526(1-2):63-73.

［18］Glen CD，Smith AG，Dubrova YE.Single-molecule PCR analysis of germ line mutation induction by anticancer drugs in mice［J］.Cancer Res，2008，68(10):3630-3636.

［19］Rungpragayphan S，Kawarasaki Y，Imaeda T，Kohda K，Nakano H，Yamane T.High-throughput，cloning-independent protein library construction by combining single-molecule DNA amplification with in vitro expression［J］.J Mol Biol，2002，318(2):395-405.

［20］Yamane T，Nakano H.Protein engineering of lipase by SIMPLEX［J］.J Agric Chem Sci(Japan)，2004，78(8):751-753.

［21］Rungpragayphan S，Nakano H，Yamane T.PCR-linked in vitro expression:a novel system for high-throughput construction and screening of protein libraries［J］.FEBS Lett，2003，540(1-3):147-150.

Expanded simple tandem repeat loci induced mutation in genetic toxicology and its progress

LIANG Chun-liu1，YAO Lang1，ZHANG Tian-bao2
(1.Department of Health Toxicology，Southern Medical University，Guangzhou510515，China;2.Department of Health Toxicology，the Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Expanded simple tandem repeats(ESTRs)are unstable tandem repetitive DNA loci，which are applied largely in induced mutation of germline，because of the high spontaneous mutation rate.So far，three types of repeat sequences have been found.They are named a small satellite，microsatellite and ESTRs，respectively.While pedigree and single-molecule PCR are used to monitor changes in repeat sequences.However，the mutation mechanisms of these repeat sequences are exactly unknown till now.So，in this paper reviewed，the similar and differences of three different repeatitive loci，the advantages and disadvantages of the two methods，as well as the mutation mechanism were focused.

tandem repeat sequences;alleles;mutation;pedigree;polymerase chain reaction

The project supported by a grant from Shanghai Key Discipline of Public Health Project(08GWZX0301)

ZHANG Tian-bao，E-mail:tbzhang2001@yahoo.com.cn

Q394.6，R965

A

1000-3002(2011)05-0487-03

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.014

上海市公共衛(wèi)生重點學(xué)科建設(shè)項目(08GWZX0301)

梁春柳(1985-)，女，碩士，主要從事遺傳毒理學(xué)研究。

張?zhí)鞂?，E-mail:tbzhang2001@yahoo.com.cn

2010-11-15接受日期:2011-02-25)

(本文編輯:付良青)