楊勝乾，龍隆，李微，王莉莉

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850)

mTEL-cFms激酶結(jié)構(gòu)域融合蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子核轉(zhuǎn)位的影響

楊勝乾，龍隆，李微，王莉莉

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850)

目的構(gòu)建激酶盤真核表達(dá)載體，觀察豆蔻?；腡EL轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HLH結(jié)構(gòu)域與c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域融合蛋白(mTEL-cFmskd)的表達(dá)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)和STAT3核轉(zhuǎn)位的影響。方法利用DNA重組技術(shù)，將人的c-Src豆蔻?；嚯?、TEL轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HLH結(jié)構(gòu)域、c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域以及c-Myc標(biāo)簽的DNA序列克隆在pCORON/neo載體上，構(gòu)建pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc真核表達(dá)載體。將載體轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)GFP-STAT1的人骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)和穩(wěn)定表達(dá)EGFP-STAT3的幼倉鼠腎細(xì)胞24 h后，采用IN Cell Analyzer1000獲取細(xì)胞圖像，分析細(xì)胞內(nèi)GFP-STAT1或EGFP-STAT3融合蛋白的核轉(zhuǎn)位程度。結(jié)果質(zhì)粒酶切和測序鑒定表明，構(gòu)建的pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc真核表達(dá)載體序列正確。載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，綠色熒光蛋白標(biāo)記的STAT1和STAT3均進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。c-Fms激酶抑制劑GW2580和Sutent能抑制mTEL-cFmskd誘導(dǎo)EGFP-STAT3核轉(zhuǎn)位的發(fā)生。結(jié)論成功構(gòu)建激酶盤真核表達(dá)載體pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc。載體在細(xì)胞中表達(dá)的mTEL-cFmskd豆蔻酰化融合蛋白具有M-CSF/c-Fms配體受體復(fù)合物激活下游信號分子的生物學(xué)功能。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體;真核表達(dá)載體;TEL;豆蔻酰化;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子;核轉(zhuǎn)位;激酶抑制劑

激酶是細(xì)胞內(nèi)一類最重要的功能蛋白，在細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用。激酶組學(xué)(kinomics)的最新研究表明，人類共有518種激酶［1］。大量研究表明，酪氨酸激酶不僅在細(xì)胞之間和細(xì)胞內(nèi)部信號傳遞、協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂等復(fù)雜過程發(fā)揮著重要的作用，還與癌癥、心血管疾?。?］、糖尿?。?］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［4］等疾病也密切相關(guān)。以酪氨酸蛋白激酶作為靶標(biāo)開發(fā)新藥，已經(jīng)成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。目前，以BCR-ABL激酶、表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)酪氨酸激酶、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)酪氨酸激酶等為靶標(biāo)研發(fā)的抑制劑，都已發(fā)展為成功的上市藥物。然而，由于激酶種類繁多，耗時、低效的分子水平激酶抑制劑的篩選方法已經(jīng)嚴(yán)重制約新的多樣化的激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)。因此，發(fā)展高效的篩選方法具有重要意義。

c-Src蛋白N端的豆蔻酰化多肽，使c-Src蛋白能夠錨定在細(xì)胞膜上［5］。TEL(轉(zhuǎn)位E26轉(zhuǎn)化特異性白血病，translocation E26 transforming-specific leukemia)是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E26轉(zhuǎn)化特異性(E26 transformation-specific，Ets)因子家族成員之一，含有兩個功能性的結(jié)構(gòu)域——易于形成二聚化的N端螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-loop-helix domain，HLH結(jié)構(gòu)域)［6］和C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域［7－8］。Melnick等［9］構(gòu)建了一種TEL轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子融合的酪氨酸激酶盤表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染白介素3(interleukin-3，IL-3)依賴的BaF3細(xì)胞后，用于激酶抑制劑的篩選。高內(nèi)涵篩選(high content screening，HCS)是一種能夠進(jìn)行熒光顯微成像和定量圖像分析的自動化篩選技術(shù)，在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，能同時檢測被篩樣品對細(xì)胞的形態(tài)、生長、周期、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的影響［10］。細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記信號分子的轉(zhuǎn)位分析是高內(nèi)涵分析細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)的基本功能之一。研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)是巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor receptor，c-Fms)等受體酪氨酸激酶下游的信號分子，被激酶激活后形成同源或異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象［11］。構(gòu)建真核表達(dá)載體將TEL的HLH結(jié)構(gòu)域與酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞中融合表達(dá)，HLH結(jié)構(gòu)域使激酶結(jié)構(gòu)域二聚化而表現(xiàn)出激酶活性，激活STATs發(fā)生核轉(zhuǎn)位，結(jié)合高內(nèi)涵分析技術(shù)，不失為一種新的、高效的激酶抑制劑篩選策略。

通過構(gòu)建激酶盤真核表達(dá)載體，將c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域與c-Src蛋白的豆蔻?；亩?、TEL轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的HLH結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)具有酪氨酸激酶活性的mTEL-cFmskd蛋白。觀察mTEL-cFmskd對c-Fms所介導(dǎo)信號通路下游信號分子STAT1和STAT3的激活作用，并探討c-Fms激酶抑制劑對mTEL-cFmskd誘導(dǎo)STAT3核轉(zhuǎn)位的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株

pCORON/neo-EGFPn，pCORON/neo-cfms質(zhì)粒由本室保存;感受態(tài)大腸桿菌(DH5α)購自天根生化科技(北京)有限公司;CHO-K1中國倉鼠卵巢細(xì)胞由本室保存，GFP-STAT1_U2OS人骨肉瘤細(xì)胞、EGFP-STAT3_BHK幼倉鼠腎細(xì)胞購自Thermo(Bio Image)公司。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、Ex Taq酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)志物(Marker)DL2000、DL5000均購自TaKa-Ra公司，KOD plus DNA聚合酶購自Toyobo公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、Hoechst33342染料購自Invitrogen公司，新霉素(G418)購自Merck公司，胎牛血清購自Hyclone公司。37%甲醛溶液購自西隴化工股份有限公司。

1.3 引物合成與測序

所用到引物的合成及DNA測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司和中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。

1.4 TEL轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HLH結(jié)構(gòu)域cDNA序列的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI序列數(shù)據(jù)庫提供的人ETV6(TEL)cDNA序列(NM_001987.4)獲得編碼TEL轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HLH結(jié)構(gòu)域的cDNA序列，長度為930 bp(275～1204 bp)。在HLH結(jié)構(gòu)域的cDNA序列下游，緊接一個多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites，MCS)，長度為39 bp。MCS下游，再接一個編碼c-Myc標(biāo)簽的DNA序列，長度為30 bp。總長度為999 bp的DNA序列，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。合成的DNA序列插入pUC19克隆載體EcoRⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，獲得pUC19-Tel-Myc質(zhì)粒載體。

1.5 PCR擴(kuò)增c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域的DNA片段

根據(jù)NCBI序列數(shù)據(jù)庫提供的人c-Fms cDNA序列(NM_005211)設(shè)計合成引物。上游引物:5'-GAAGAGCTAGCGTACAAGTATAAGCAGAAGCC-3';下游引物:5'-AGTACGGATCCCGCAGAACTGATAGTTGTTGG-3'。以pCORON/neo-cfms質(zhì)粒為模板，采用KOD plus DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增編碼c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域的DNA片段。PCR條件:94℃，2 min;94℃，20 s，55℃，20 s，68℃，1 min 30 s，循環(huán)30次;68℃，10 min。

1.6 質(zhì)粒載體的構(gòu)建

合成編碼人c-Src豆蔻?；嚯牡腄NA序列HcSrcsense:5'-CTAGCATGGGTAGCAACAAGAGCAAGCCCAAGGATGCCAGCCAGCGGCGCCGCG-3';antisense:5'-AATTCGCGGCGCCGCTGGCTGGCATCCTTGGGCTTGCTC TTGTTGCTACCCATG-3'。將該DNA序列連接到pCORON/neo-EGFPn載體中，經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、單克隆菌落PCR及DNA測序鑒定，獲得pCORON/neo-HcSrc-EGFPn質(zhì)粒。用NheⅠ和BamHⅠ分別酶切pUC19-Tel-Myc質(zhì)粒及編碼c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域的DNA片段回收產(chǎn)物，再經(jīng)凝膠電泳回收、T4DNA酶連、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、菌落PCR、限制性酶切及測序鑒定，獲得pUC19-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒。pCORON/neo-HcSrc-EGFPn質(zhì)粒及pUC19-Telcfmskd-Myc質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，經(jīng)凝膠電泳回收等步驟，獲得pCORON/neo-HcSrc-Telcfmskd-Myc-EGFPn質(zhì)粒。合成含有終止密碼子的DNA序列MTAA，sense:5'-CTAGAGTCGACTAAGC-3';antisense:5'-GGCCGCTTAGTCGACT-3'。用XbaⅠ和NotⅠ切除pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFPn質(zhì)粒中的EGFP DNA片段，將MTAA序列連接到質(zhì)粒中，獲得pCORON/neo-HcSrc-Telcfmskd-Myc載體。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

CHO-K1細(xì)胞用含有10%FBS、青霉素5000 kU·L－1/鏈霉素5000 kU·L－1的F12培養(yǎng)基，GFPSTAT1_U2OS人骨肉瘤細(xì)胞、EGFP-STAT3_BHK幼倉鼠腎細(xì)胞用含有10%FBS、G418 500 mg·L－1的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2，80%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將密度調(diào)整為1×108L－1。將細(xì)胞接種于黑色透底的96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，使用相應(yīng)的培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，80%濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞的豐度達(dá)到80%～90%后，使用LipofectamineTM2000將質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。首先將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換成無血清無抗生素培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育1 h。期間制備質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，將0.5 μl LipofectamineTM2000加入到24.5 μl無血清無抗生素培養(yǎng)基中，混勻，室溫靜置5 min。期間將200 ng的質(zhì)粒加入到24.5 μl無血清無抗生素培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將質(zhì)粒培養(yǎng)基混合物與靜置5 min的LipofectamineTM2000培養(yǎng)基混合物按1∶1混合，輕輕混勻，室溫靜置20 min。20 min后，將細(xì)胞換成新鮮的無血清無抗生素培養(yǎng)基，每孔50 μl。再將制備好的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物加入培養(yǎng)板，每孔50 μl，輕微振板混勻，置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)6 h后，換成完全培養(yǎng)基每孔100 μl，37℃，5%CO2，80%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.9 細(xì)胞形態(tài)的觀察及分析

采用LipofectamineTM2000將質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞用37℃預(yù)熱PBS 0.01 mol·L－1稀釋的8%(V/V)甲醛溶液固定，每孔100 μl，室溫避光放置20 min。棄液，加入含有Hoechst33342 1 μmol·L－1染料的PBS 0.01 mol·L－1，每孔200 μl，室溫避光放置30 min或4℃放置過夜。IN Cell Analyzer1000獲取細(xì)胞圖像，用細(xì)胞膜定位分析模塊(Membrane Trafficking Analysis Module)和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)分析模塊分析得到的細(xì)胞圖像。以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)膜定位的細(xì)胞比率表示豆蔻?；嚯哪ゅ^定功能的強(qiáng)弱，綠色熒光膜定位的細(xì)胞比率=熒光發(fā)生膜定位細(xì)胞數(shù)/表達(dá)GFP細(xì)胞總數(shù);以轉(zhuǎn)核指數(shù)表示綠色熒光的轉(zhuǎn)核程度，轉(zhuǎn)核指數(shù)=每孔獲得細(xì)胞的細(xì)胞核平均熒光亮度/細(xì)胞質(zhì)平均熒光亮度。

1.10 c-Fms激酶抑制劑活性的檢測

將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，加入分別含終濃度為0.03和0.3 μmol·L－1的c-Fms抑制劑GW2580或Sutent的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞固定、Hoechst33342染料處理。IN Cell Analyzer1000獲取細(xì)胞圖像，分析GFP的轉(zhuǎn)核程度。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 c-Src蛋白豆蔻?；嚯牡募?xì)胞膜錨定功能驗(yàn)證

將合成的編碼人c-Src蛋白豆蔻?；嚯牡腄NA序列(圖1A)，連接到含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced GFP，EGFP)的質(zhì)粒中，構(gòu)建pCORON/neo-HcSrc-EGFPn真核表達(dá)載體(圖1B)。通過菌落PCR鑒定，得到含有目標(biāo)載體的單克隆菌落(圖1C)。提取pCORON/neo-HcSrc-EGFPn質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定后，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。載體轉(zhuǎn)染24 h后，甲醛固定細(xì)胞并分析細(xì)胞內(nèi)GFP的細(xì)胞膜分布情況。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pCORON/neo-EGFPn載體相比，轉(zhuǎn)染pCORON/neo-HcSrc-EGFPn載體細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，更多地分布在細(xì)胞膜上，而不是均勻地分布在細(xì)胞內(nèi)(圖2)。轉(zhuǎn)染pCORON/neo-HcSrc-EGFPn載體24 h后，綠色熒光發(fā)生膜定位的細(xì)胞占表達(dá)綠色熒光細(xì)胞總數(shù)的(88.8±1.3)%，顯著高于轉(zhuǎn)染pCORON/neo-EGFPn載體組的(51.2±1.7)%(n=4，P＜0.01)。

圖1 pCORON/neo-HcSrc-EGFPn質(zhì)粒的構(gòu)建.A:編碼人c-Src蛋白豆蔻酰化多肽的DNA序列HcSrc.B:pCORON/neo-HcSrc-EGFPn質(zhì)粒.C:單克隆菌落產(chǎn)物(944 bp).M:DL2000標(biāo)志物;泳道1～10為可能含有pCORON/neo-HcSrc-EGFPn質(zhì)粒的菌落.Fig.1 Construction of pCORON/neo-HcSrc-EGFPn plasmid.

圖2 HcSrc融合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的CHO-K1細(xì)胞膜定位.pCORON/neo-EGFPn(A)和pCORON/neo-HcSrc-EGFPn(B)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞24 h.Fig.2 Localization of HcSrc-fused enhanced green fluorescent protein(EGFP)on CHO-K1 cell membrane.

2.2 PCR 擴(kuò)增的c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域DNA片段及構(gòu)建的重組載體

將設(shè)計合成編碼HLH結(jié)構(gòu)域和c-Myc標(biāo)簽的DNA片段(圖3A)連接在pUC19克隆載體上，獲得pUC19-Tel-Myc質(zhì)粒。以含有c-Fms全長cDNA的pCORON/neo-cfms質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增編碼c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域的DNA片段。與pUC19-Tel-Myc質(zhì)粒分別行限制性酶切并回收后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量(圖3B)。經(jīng)T4 DNA酶聯(lián)反應(yīng)、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、富集培養(yǎng)提取質(zhì)粒，再經(jīng)限制性酶切鑒定(圖3C)，獲得pUC19-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒。

圖3 pUC19-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒的構(gòu)建.A.重組Tel cDNA.B.NheⅠ＆BamHⅠ酶切的c-fmskd(1)和pUC19-Tel-Myc質(zhì)粒(2).C.酶切pUC19-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒凝膠電泳結(jié)果.M:DL5000標(biāo)志物.泳道1～3:XhoⅠ(3629 bp+1325 bp)酶切質(zhì)粒;泳道4～6:XbaⅠ+EcoRⅠ(2659 bp+2295 bp)酶切質(zhì)粒;泳道7～9:HindⅢ+XhoⅠ(2753 bp+1325 bp+876 bp)酶切質(zhì)粒.Fig.3 Construction of pUC19-Tel-cfmskd-Myc plasmid.

用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切pUC19-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒，釋放出Tel-cfmskd-Myc DNA片段。將該DNA片段連接到pCORON/neo-HcSrc-EGFPn載體上，使得Tel-cfmskd-Myc DNA片段緊接在HcSrc的下游，得到pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFPn。為了檢測載體中插入片段能否完整地在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，將pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFPn載體瞬時轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，能在細(xì)胞中表達(dá)出GFP，且部分GFP定位在細(xì)胞膜上(圖4C)。說明HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFP DNA片段能在細(xì)胞中完整的表達(dá)。

圖4 CHO-K1細(xì)胞內(nèi)EGFP的表達(dá).A，B，C分別為轉(zhuǎn)染了pCORON/neo-EGFPn，pCORON/neo-HcSrc-EGFPn和pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFPn質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞.Fig.4 Expression of EGFP in CHO-K1 cells.

為使EGFP不影響c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域的活性，用XbaⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶切除pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFPn載體中的EGFP DNA片段，同時在c-Myc標(biāo)簽DNA序列下游插入含有終止密碼子的MTAA序列，得到pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc載體(圖5)。

2.3 mTEL-cFmskd對STAT1/3核轉(zhuǎn)位的影響

分別將pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc載體轉(zhuǎn)染GFP-STAT1_U2OS細(xì)胞和EGFP-STAT3_BHK細(xì)胞，使mTEL-cFmskd在細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測細(xì)胞中綠色熒光的核轉(zhuǎn)位程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染試劑對照組相比，轉(zhuǎn)染pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc載體細(xì)胞組中的GFP進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。由于轉(zhuǎn)染pCORON/neo-cfms載體的細(xì)胞中瞬時表達(dá)大量的c-Fms受體激酶，受體激酶彼此靠近活化激酶結(jié)構(gòu)域，激活下游的信號分子STAT1和STAT3，導(dǎo)致綠色熒光標(biāo)記的STAT1和STAT3進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，但程度明顯低于表達(dá)mTEL-cFmskd的細(xì)胞組(表1，圖6)。

圖5 pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒的構(gòu)建.A:pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒圖.B:M:DL5000標(biāo)志物;泳道1～3:EcoRⅠ+NotⅠ(5457 bp+2311 bp)酶切質(zhì)粒;泳道4～6:EcoRⅠ+KpnⅠ(4560 bp+3208 bp)酶切質(zhì)粒;泳道7～9:XbaⅠ+HindⅢ(3815 bp+2678 bp+1275 bp)酶切質(zhì)粒.Fig.5 Construction of pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc plasmid.

表1 轉(zhuǎn)染pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc載體對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)和-STAT3核轉(zhuǎn)位的影響Tab.1 Effect of pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc transfection on signal transducers and activators of transcription(STAT)1 and STAT3 nuclear translocation in GFP-STAT1_U2OS and EGFP-STAT3_BHK cells

圖6 mTEL-cFmskd融合蛋白誘導(dǎo)STAT1和STAT3發(fā)生核轉(zhuǎn)位.見圖1處理.A:GFP-STAT1_U2OS;B:EGFP-STAT3_BHK;1:LipofectamineTM2000;2:pCORON/neo-cfms質(zhì)粒;3:pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc質(zhì)粒.Fig.7 STAT1 and STAT3 nuclear translocation induced by mTEL-cFmskd.

2.4 c-Fms激酶抑制劑對mTEL-cFmskd誘導(dǎo)的STAT3核轉(zhuǎn)位的影響

表2結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染無藥物處理組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)核指數(shù)明顯增加(P＜0.01)，說明mTEL-cFmskd融合蛋白可顯著誘導(dǎo)STAT3發(fā)生核轉(zhuǎn)位。與轉(zhuǎn)染無藥物處理組相比，加入GW2580或Sutent 0.3 μmol·L－1可有效抑制mTEL-cFmskd誘導(dǎo)STAT3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，但濃度為0.03 μmol·L－1時，兩藥均無抑制作用。

表2 c-Fms激酶抑制劑對mTEL-cFmskd誘導(dǎo)的STAT3核轉(zhuǎn)位的影響Tab.2 Effect of c-Fms inhibitors on STAT3 nuclear translocation induced by mTEL-cFmskd

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建激酶盤真核表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的mTEL-cFmskd豆蔻酰化融合蛋白包括4個部分:HcSrc豆蔻?；嚯?、TEL轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HLH結(jié)構(gòu)域、c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域和c-Myc免疫印跡標(biāo)簽，分別具有錨定細(xì)胞膜、二聚化、酪氨酸激酶活性等功能。在c-Src蛋白的生物合成過程中，N端的甲硫氨酸被切除，導(dǎo)致緊接著的甘氨酸殘基與豆蔻酰輔酶A(myristoyl-CoA)反應(yīng)，結(jié)果在甘氨酸殘基上添加了一個具有十四碳鏈的豆蔻?；鶊F(tuán)［5］。具有豆蔻?；鶊F(tuán)的c-Src蛋白能夠錨定在細(xì)胞膜上，而以甘氨酸殘基開始的7個氨基酸殘基是豆蔻?；鶊F(tuán)形成所必須的［12］。TEL是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，含有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和HLH結(jié)構(gòu)域，而HLH結(jié)構(gòu)域易發(fā)生二聚化［13］。HLH結(jié)構(gòu)域的二聚化使兩個c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域相互靠近，催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的酪氨酸殘基磷酸化，活化激酶活性，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)磷酸作用，激活下游的信號分子。STATs家族分子是酪氨酸受體激酶下游的主要信號分子，主要參與細(xì)胞JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的信號傳遞過程，被激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。STATs的核轉(zhuǎn)位程度，直接反映了上游特定激酶或者受體的活性。文獻(xiàn)報道表明，除包括c-Fms［14］、EGFR［15－16］、成纖維細(xì)胞生長因子受體、胰島素樣生長因子1受體、VEGFR、PDGFR［17］、干細(xì)胞生長因子受體［18］等酪氨酸蛋白激酶受體超家族成員外，IL-2R，IL-3R等其他細(xì)胞因子受體也直接或通過SRC［19］，JAKs［20］間接地激活STATs，誘導(dǎo)其發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。這提示，本實(shí)驗(yàn)建立的激酶盤真核表達(dá)載體有廣泛的實(shí)用性。

本實(shí)驗(yàn)利用DNA重組技術(shù)，將人c-Src豆蔻?；嚯?、TEL蛋白的HLH結(jié)構(gòu)域、c-Fms激酶結(jié)構(gòu)域、c-Myc標(biāo)簽以及EGFP的DNA序列克隆到載體上，構(gòu)建了pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc-EGFPn真核表達(dá)載體，并通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)染CHO-K1倉鼠卵巢細(xì)胞，結(jié)果表明該載體能夠在細(xì)胞中表達(dá)出GFP。說明HcSrc-Tel-cfmskd DNA片段沒有發(fā)生移碼突變，可以表達(dá)完整的mTEL-cFmskd融合蛋白。用限制性內(nèi)切酶切除載體中的EGFP DNA序列，通過添加終止密碼子，成功獲得pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc載體。轉(zhuǎn)染了此載體的GFP-STAT1_U2OS人骨肉瘤細(xì)胞和EGFP-STAT3_BHK幼倉鼠腎細(xì)胞中發(fā)生GFPSTAT1和EGFP-STAT3核轉(zhuǎn)位;c-Fms激酶抑制劑能有效抑制mTEL-cFmskd誘導(dǎo)EGFP-STAT3核轉(zhuǎn)位的發(fā)生。說明激酶盤真核載體表達(dá)的mTEL-cFmskd具有M-CSF/c-Fms配體受體復(fù)合物的生物學(xué)作用。然而，載體構(gòu)建過程中酶切位點(diǎn)的局限性和載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞方式的低效率將是我們亟需解決的問題。分選獲得穩(wěn)定表達(dá)mTEL-cFmskd的EGFPSTAT3_BHK單克隆細(xì)胞株，可能更有利于建立可靠的細(xì)胞模型。

綜上所述，成功構(gòu)建pCORON/neo-HcSrc-Telcfmskd-Myc真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)的mTEL-cFmskd能誘導(dǎo)STATs轉(zhuǎn)位，具有M-CSF/c-Fms配體受體復(fù)合物激活下游信號分子的生物學(xué)功能。該體系為快速建立種類齊全的激酶抑制劑篩選模型提供了一種可靠的通用模式，結(jié)合高內(nèi)涵分析技術(shù)，可能成為激酶抑制劑篩選的高效方法。

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Establishment of mTEL-cFmskd eukaryotic expression vector and its effect on STAT1/3 nuclear translocation

YANG Sheng-qian，LONG Long，LI Wei，WANG Li-li
(Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China)

OBJECTIVETo construct a eukaryotic expression vector of mTEL-cFmskd and study its effect on nuclear translocation of the signal transducer and activator of transcription 1/3(STAT1/3).METHODSBy recombinant DNA technology，the DNA sequence of polypeptide for myristoylation of human c-Src，helix-loop-helix domain of human TEL，kinase domain of macrophage colony-stimulating factor receptor and c-Myc tag were inserted into pCORON/neo plasmid to generate pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc eukaryotic expression vector.The mTEL-cFmskd expression vector pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc and the c-Fms expression vector pCORON/neo-cfms were transfected into U2OS(expressing GFP-STAT1)and BHK(expressing EGFPSTAT3)cells.After 24 h，the cells were fixed，stained and then imaged on the IN Cell Analyzer 1000.The image was analyzed using the Nuclear Trafficking Analysis Module.RESULTSRestriction enzyme digestion and plasmid sequencing confirmed the successful construction of pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc plasmid.mTEL-cFmskd was expressed in cells，and caused nuclear translocation of GFP-STAT1 and EGFP-STAT3 24 h after transfection.c-Fms inhibitors GW2580 and Sutent could block the nuclear translocation of EGFP-STAT3 by mTEL-cFmskd.CONCLUSIONmTEL-cFmskd expression vector pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc is successfully constructed and functional mTEL-cFmskd is expressed in GFP-STAT1_U2OS and EGFPSTAT3_BHK cells.

macrophage colony-stimulating factor receptor;TEL;myristoylation;STATs;nuclear translocation;kinase inhibitors

The project supported by National Mega-project of Science Research of China(2009ZX09501-031)

WANG Li-li，E-mail:wangll63@yahoo.com.cn，Tel:(010)66874603

R966，Q81

A

1000-3002(2011)05-0456-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.008

(來稿日期:2011-04-28接受日期:2011-08-24)

(本文編輯:喬虹)