王志遠(yuǎn)，張 宏，張革化

白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥與對(duì)策＊

王志遠(yuǎn)1，張 宏2，張革化1

隨著廣譜抗生素、化療藥的廣泛使用，器官移植手術(shù)和患有基礎(chǔ)疾病的人群數(shù)量的激增，白念珠菌已成為人類(lèi)真菌感染的最常見(jiàn)的病原菌。一線抗真菌藥氟康唑等唑類(lèi)藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用，白念珠菌的耐藥株已廣泛出現(xiàn)，引起臨床醫(yī)生的廣泛關(guān)注。本文主要介紹白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制以及如何逆轉(zhuǎn)耐藥相關(guān)對(duì)策的研究工作的新進(jìn)展。

1 白念珠菌感染現(xiàn)狀

白念珠菌（Candida albicans）為念珠菌屬中的主要致病菌，是一種常見(jiàn)的條件致病性的真菌，可寄居于正常人群中的胃腸道、陰道和口腔粘膜。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，可導(dǎo)致口腔念珠菌病、陰道炎、真菌性鼻竇炎、外耳道炎等，甚至可引發(fā)危及生命的系統(tǒng)性念珠菌感染。在美國(guó)，8%～10%的醫(yī)院血流感染（nosocomial bloodstream infection，BSI）的主要致病菌為念珠菌屬。國(guó)外多中心統(tǒng)計(jì)了1997－2007年的256 882例醫(yī)院真菌感染中，白念珠菌占65．3%［1］。土耳其某三級(jí)醫(yī)院回顧研究了1996－2007年12年間743例念珠菌菌血癥患者，發(fā)現(xiàn)白念珠菌感染者占45%［2］。最近2項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，白念珠菌血流感染患者病死率分別為44%和43．6%［3－4］。由此可見(jiàn)，白念珠菌感染率和病死率高，已成為人類(lèi)的健康殺手。

2 白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥現(xiàn)狀

氟康唑、伊曲康唑等三唑類(lèi)藥物因其安全和有效性，成為臨床上治療念珠菌病最常用的一線抗真菌藥物。但是，此類(lèi)藥物的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致耐藥株廣泛出現(xiàn)。41個(gè)國(guó)家多中心研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥株已從2000年的0．9%上升到了2007年的1．4%［1］。Goldman等（2000）對(duì)免疫缺陷病人進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑治療組與安慰劑組分離培養(yǎng)的白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率分別為22%和4%。Wroblewska等［5］從臨床上分離了851株白念珠菌，其中37．2%對(duì)氟康唑耐藥、47．6%對(duì)伊曲康唑耐藥。Magaldi等（2001）從艾滋病患者身上分離培養(yǎng)出白念珠菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)氟康唑原發(fā)耐藥率為10%，而經(jīng)抗真菌治療后耐藥率上升為45%。白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥已經(jīng)成為臨床棘手的問(wèn)題。目前，有關(guān)白念珠菌的耐藥機(jī)制的研究主要包括藥物外排泵的改變、靶酶的變化、生物膜的形成、細(xì)胞壁成分的變化等方面。

2．1 藥物外排泵的改變

2．1．1 藥物外排泵 Sanglard（1995）和 Albertson（1996）的研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性與能量依賴的外排泵相關(guān)。研究證實(shí)2個(gè)外排泵系統(tǒng)與白念珠菌氟康唑耐藥相關(guān)［6］：①ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子（ATP binding cassette transporters，ABC；CDR 編碼），依賴ATP主動(dòng)運(yùn)輸。研究推測(cè)ABC的數(shù)量為28個(gè)，主要包括CDR1p和CDR2p，其編碼基因分別為CDR1和CDR2。唑類(lèi)耐藥白念珠菌中CDR1轉(zhuǎn)錄增加與CDR1 m RNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，引起CDR1的過(guò)表達(dá)，而CDR1p通過(guò)介導(dǎo)脂質(zhì)的移位、外排唑類(lèi)藥物而發(fā)揮其耐藥作用［7］。目前已證實(shí)CDR1與或CDR2過(guò)表達(dá)與白念珠菌對(duì)唑類(lèi)的耐藥相關(guān)［8］。White等（1997）研究同一親本的16株白念珠菌，發(fā)現(xiàn)耐藥白念珠菌的CDR mRNA水平明顯升高，認(rèn)為白念珠菌的耐藥與CDR家族中成員有關(guān)。Sanglard等（1997）研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌被敲除CDR1基因后，表現(xiàn)為對(duì)唑類(lèi)藥物高度敏感，在前者菌株基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除CDR2基因后，對(duì)唑類(lèi)藥物的敏感度進(jìn)一步提高。②主要易化子超家族（major facilitators superfamily，MFS；MDR 編碼），屬非能量依賴型載體，通過(guò)電化學(xué)勢(shì)能進(jìn)行被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。在白念珠菌中，它至少包括Ca MDR1p和FLU1p，編碼基因分別為Ca MDR1和FLU1。白念珠菌的MDR1的過(guò)量表達(dá)是白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥的另一個(gè)主要機(jī)制［9］。白念珠菌和釀酒酵母菌中FLU1基因氨基酸序列與Ca MDR1類(lèi)似，其基因缺失突變株對(duì)唑類(lèi)藥物敏感性增強(qiáng)，但其在敏感株與耐藥株中表達(dá)無(wú)明顯差異［10］。White（2002）亦證實(shí)FLU1基因與白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性及ERG11高表達(dá)無(wú)關(guān)。說(shuō)明了FLU1對(duì)菌株耐藥無(wú)明顯影響。

2．1．2 外排泵的調(diào)控 ①轉(zhuǎn)錄因子Ca Tac1（transcriptional activator of CDR genes）控制著外排泵CaCdr1p、CaCdr2p的表達(dá)。Ca Tac1獲得功能性突變可導(dǎo)致CDR1、CDR2的高表達(dá)，CDR1缺失突變株對(duì)氟康唑、伊曲康唑、酮康唑耐藥性分別降低6、4、8倍，而CDR2缺失突變株對(duì)氟康唑或酮康唑耐藥性降低1．5倍，對(duì)伊曲康唑沒(méi)有影響，因此認(rèn)為CDR1在白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性上發(fā)揮主要作用，而CDR2作用輕微［11］；②白念珠菌鈣－鈣調(diào)蛋白（Ca2＋－Ca M）依賴性途徑參與耐藥的調(diào)節(jié)。Ca M抑制劑吩噻嗪類(lèi)能抑制白念珠菌Ca M編碼基因Ca MDR1表達(dá)Ca MDR1p，使Ca MDR1p對(duì)靶蛋白鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶作用減弱，鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白CRZ1p的活化減弱，使白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物敏感性增加。實(shí)驗(yàn)證明Ca M抑制劑能夠增強(qiáng)酮康唑抗白念珠菌活性［12］。③ 轉(zhuǎn) 錄 因 子 MRR1 （multidrug resistance regulator）能上調(diào)耐藥的白念珠菌的MDR1，MRR1是MDR1關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，MRR1的失活將導(dǎo)致MDR1表達(dá)水平和耐藥性下降［13］；④外排泵調(diào)節(jié)因子1（regulator of efflux pump 1，REP1）的過(guò)表達(dá)使菌株對(duì)氟康唑敏感性增加，而REP1基因突變引起MDR1 mRNA過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性增加。因此，Rep1p為白念珠菌MDR1的負(fù)性調(diào)控因子［9］。

2．2 靶酶的變化

2．2．1 靶酶及其編碼基因 麥角固醇是真菌細(xì)胞膜上最常見(jiàn)的固醇，唑類(lèi)藥物與麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450羊毛固醇脫甲基酶（ERG11編碼）結(jié)合，抑制麥角固醇的合成，從而抑制真菌的生長(zhǎng)。當(dāng)靶酶過(guò)度表達(dá)或突變時(shí)，真菌便表現(xiàn)出對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性。已經(jīng)證實(shí)與耐藥相關(guān)的靶酶基因?yàn)镋RG11（或稱為ERG16、CYP51A1）。Ribeiro等［14］通過(guò)比較氟康唑敏感株與耐藥株，發(fā)現(xiàn)ERG11的上調(diào)與氟康唑誘導(dǎo)耐藥有關(guān)。而Wang等［15］通過(guò)鎖式探針和滾環(huán)擴(kuò)增（rolling cycle amplification，RCA）方法快速檢測(cè)白念珠菌ERG11基因的突變位點(diǎn)，篩選到G464 S、G448E、G307S、K143R、Y123H、S405F 、R467K 、G450V 氨基酸位點(diǎn)置換導(dǎo)致白念珠菌對(duì)氟康唑敏感度下降。Feng等［16］的研究認(rèn)為F72S、F145I和G227D氨基酸位點(diǎn)置換與白念珠菌對(duì)唑類(lèi)的耐藥高度相關(guān)。

2．2．2 靶酶編碼基因調(diào)控 在靶酶基因水平調(diào)控方面，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Upc2p是固醇生物合成和唑類(lèi)耐藥的重要調(diào)節(jié)因子。UPC2介導(dǎo)麥角固醇生物合成基因的上調(diào)，可導(dǎo)致白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性。白念珠菌UPC2基因缺失致其對(duì)唑類(lèi)藥物酮康唑、氟康唑的敏感性增加［17］，而UPC 2基因的G648D或A643T功能獲得性突變則導(dǎo)致ERG11過(guò)度表達(dá)，使白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥增加［18］。Upc2p直接結(jié)合ERG基因的啟動(dòng)子從而調(diào)控ERG2、ERG11基因的表達(dá)［17］。

2．3 生物膜的形成

2．3．1 生物膜及其耐藥性 單個(gè)真菌粘附到底物表面，成為微菌落，依靠菌毛及富含多聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）融合產(chǎn)生復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，形成生物膜。生物膜內(nèi)包括酵母細(xì)胞、菌毛、假菌毛。白念珠菌生物膜早期為0～11 h，細(xì)胞開(kāi)始粘附到底物上；中期為12～24 h，芽生孢子聚集增殖形成群落，產(chǎn)生富含碳水化合物的ECM；成熟期為31～72 h，細(xì)胞完全包被于ECM中，72 h后細(xì)胞開(kāi)始死亡，生物膜結(jié)構(gòu)開(kāi)始分解。Uppuluri等［19］研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌生物膜相較懸浮相對(duì)氟康唑的耐藥性提高1 000多倍。

2．3．2 生物膜耐藥機(jī)制 生物膜的形成機(jī)制尚不清楚。Mukherjee等（2004）認(rèn)為，在生物膜形成初期，白念珠菌外排泵的表達(dá)與其對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥有關(guān)，外排泵基因的敲除不影響突變株生物膜的形成；在生物膜中后期，細(xì)胞膜固醇的改變與生物膜對(duì)唑類(lèi)藥物耐藥有關(guān)。然而，LaFleur等［20］研究白念珠菌成熟期生物膜時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型與外排泵基因的缺失突變株對(duì)抗真菌藥的MIC值一致，因此否定了外排泵對(duì)耐藥性的影響，證實(shí)白念珠菌生物膜多藥耐藥性主要是由于新亞群的耐藥株的出現(xiàn)，并確定耐藥株為表型突變而不是基因突變。由此可見(jiàn)外排泵的改變不是生物膜形成的單一因素，其它的相關(guān)蛋白與信號(hào)通路亦參與了生物膜的形成。Seneviratne等［21］以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較白念珠菌生物膜相與懸浮相全組蛋白，發(fā)現(xiàn)生物膜的形成與烷基過(guò)氧化氫還原酶、硫氧還蛋白及其過(guò)氧化物酶等氧化應(yīng)激防御蛋白的上調(diào)有關(guān)。神經(jīng)鈣蛋白抑制劑FK506聯(lián)合氟康唑可有效抑制生物膜形成，此結(jié)果間接說(shuō)明了神經(jīng)鈣蛋白信號(hào)通路與生物膜形成有關(guān)［19］。

2．4 ERG3基因的改變 ERG3基因的突變引起固醇△5，6去飽和酶（sterol delta 5，6 desaturation）缺失，導(dǎo)致14－甲基糞甾醇（14－methylfecosterol）積累，而其可以支持真菌細(xì)胞生長(zhǎng)，因此，ERG3的突變可引起白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性。Yan等［22］研究發(fā)現(xiàn)ERG3基因D19E氨基酸位點(diǎn)變化，引起ERG3基因失活，導(dǎo)致白念珠菌對(duì)氟康唑產(chǎn)生耐藥性。Efg1負(fù)性調(diào)控ERG3基因的表達(dá)從而介導(dǎo)白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性［23］。Hsp90在一定程度上調(diào)節(jié)ERG3基因的變化。Hsp90是一種分子伴侶，在靶蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟、降解的過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。Hsp90具有類(lèi)似“電容器”的功能，能夠儲(chǔ)存和釋放基因的變異。Hsp90能夠儲(chǔ)存隱性的基因變化，當(dāng)“電容器”的緩沖功能被抑制時(shí)，新的表型就會(huì)出現(xiàn)。Cowen和Lindquist［24］研究發(fā)現(xiàn)高水平的Hsp90通過(guò)快速選擇誘導(dǎo)和維持白念珠菌和釀酒酵母對(duì)氟康唑的耐藥性。Hsp90主要與底物鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin）作用引起ERG3基因的突變，從而誘導(dǎo)真菌對(duì)氟康唑的耐藥性，并且證實(shí)Hsp90抑制劑格爾德霉素（geldanamycin）和鈣調(diào)磷酸酶的抑制劑環(huán)孢菌素（Cs A）能夠降低真菌對(duì)氟康唑的耐藥性。研究證實(shí)在依賴Hsp90的藥物抵抗機(jī)制中Hsp90和鈣調(diào)磷酸酶下游效應(yīng)子Crz1、Hph1／Hph2參與了對(duì)唑類(lèi)藥物的抵抗性［25］。

2．5 細(xì)胞膜成份的改變 細(xì)胞膜固醇、磷脂和脂肪酸等成份的改變影響其流動(dòng)性和不對(duì)稱性，進(jìn)而影響藥物進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的產(chǎn)生耐藥性。Loffer等（2000）比較了氟康唑敏感菌與耐藥株的細(xì)胞膜成份，發(fā)現(xiàn)耐藥株的麥角固醇含量和磷酸卵磷酯：腦磷酯比率更低，這些變化影響了細(xì)胞膜對(duì)氟康唑的攝取，引起胞內(nèi)氟康唑濃度降低，導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生。同樣，Mishra等［26］認(rèn)為氟康唑耐藥株麥角固醇低含量、而腦磷酯高含量與白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥相關(guān)。

2．6 白念珠菌細(xì)胞周期的改變 白念珠菌的細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期、M期和G0態(tài)。耐唑類(lèi)藥物白念珠菌處于G0態(tài)時(shí)間較長(zhǎng)，此時(shí)，SNZ1高表達(dá)靜止期同源蛋白（SNZlp）。白念珠菌細(xì)胞凋亡的比率不隨唑類(lèi)藥物存在、培養(yǎng)時(shí)間或生長(zhǎng)速率而變化，保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的值，說(shuō)明其凋亡受基因控制，外界因素的誘導(dǎo)對(duì)其影響甚微［27］。

2．7 白念珠菌染色體的改變 Selmecki等研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌在氟康唑藥物的存在下迅速出現(xiàn)等臂染色體5L（isochromosome 5L），認(rèn)為白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性與染色體獲得性非整倍性有關(guān)。等臂染色體5L通過(guò)擴(kuò)增ERG11和TAC1基因引起白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性［28］。

2．8 多重耐藥 白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥可能涉及多重耐藥機(jī)制。約85%的氟康唑耐藥菌株出現(xiàn)CaCDR1、CaCDR2和Ca MDR1過(guò)表達(dá)的情況［29］。White（1997）等研究了一套具有同一親本的白念珠菌，發(fā)現(xiàn)CDR、MDR1、ERG16在每株菌中有不同程度的表達(dá)。Perea等（2001）發(fā)現(xiàn)55%的氟康唑耐藥白念珠菌株同時(shí)伴有ERG11點(diǎn)突變與外排泵（包括CDR／MDR1）上調(diào)，15%伴有ERG11與MDR1的上調(diào)，15%伴有ERG11與CDR的上調(diào)，10%伴有ERG11上調(diào)與ERG11點(diǎn)突變。因此，應(yīng)從整體的水平理解白念珠菌對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥的耐藥。

3 耐藥對(duì)策

目前白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥日趨嚴(yán)重。為了應(yīng)對(duì)白念珠菌的耐藥現(xiàn)象，可行的策略有：①規(guī)范用藥：間歇性的、長(zhǎng)期的、低劑量的用藥可導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，為防止耐藥的產(chǎn)生，應(yīng)杜絕抗真菌藥物的不合理應(yīng)用。理論上持續(xù)性的、短期的、高劑量的用藥可降低耐藥的發(fā)生率，然而在高選擇壓力下可能會(huì)出現(xiàn)更高耐藥的菌株。②新藥的開(kāi)發(fā)：新藥的開(kāi)發(fā)是逆轉(zhuǎn)耐藥的重要的措施。新一代的三唑類(lèi)抗真菌藥伏立康唑（voriconazole）抗菌譜較廣，已用于臨床?？ú捶覂簦╟aspofungin）和米卡芬凈（micafungin）分別是第一個(gè)和第二個(gè)棘球白素類(lèi)抗真菌藥物，它們是1，3－b－葡聚糖合成酶的抑制劑，可作用于真菌細(xì)胞壁，致使細(xì)胞破裂而發(fā)揮作用，現(xiàn)已用于致命性的真菌感染［30］。③聯(lián)合用藥：聯(lián)合用藥包括兩種抗真菌藥或一種抗真菌藥與一種其它藥物制劑聯(lián)合使用。目前被證明可行的組合有兩性霉素B與5－氟胞嘧啶（5－FC）、兩性霉素B與唑類(lèi)、唑類(lèi)與5－FC、唑類(lèi)與特比萘芬（terbinafine）、唑類(lèi)與環(huán)孢菌素（Cs A）等。此外，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素可在轉(zhuǎn)錄水平抑制外排泵及靶酶基因的表達(dá)，漢防己甲素對(duì)唑類(lèi)藥物抗白念珠菌有明顯的增效作用［6］。④免疫調(diào)節(jié)藥物的應(yīng)用：治療的成敗不僅與藥物而且與宿主的免疫狀況有關(guān)。唑類(lèi)藥物可聯(lián)合細(xì)胞因子治療伴有HIV等免疫缺陷的真菌感染患者。⑤清除病灶：通過(guò)外科手段去除真菌病灶以減輕真菌的負(fù)荷，從而使宿主和抗真菌藥能有效的控制真菌感染。

綜上所述，臨床上白念珠菌感染率較高，并且隨著唑類(lèi)抗真菌藥的廣泛使用，白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性不斷提高，而新型的抗真菌藥的開(kāi)發(fā)緩慢，這已經(jīng)成為臨床上較為棘手的問(wèn)題。如何逆轉(zhuǎn)白念珠菌對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥物的耐藥是擺在每一個(gè)醫(yī)務(wù)人員面前的迫切需要解決的問(wèn)題。

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1002－2694（2011）12－1126－04

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2011－06－19；

2011－07－18